众所周知，免疫组化检测及质控“没那么简单”；本期请看CD30表达评估中的陷阱及相关质控问题。

CD30表达评估中的陷阱

检测前问题

需要注意的是，免疫组化结果取决于检测前组织处理和检测所用方法。就检测前的问题来说，手术过程或组织取材过程可能会造成细胞被挤压，此时常见与所用抗体无关的非特异性着色。标本因运送延迟、固定液不足、固定时间不足、组织较大等也可导致固定欠佳。不过，过度固定可导致色素沉积并干扰抗原修复。用B5固定液及Zenker固定液也会影响对CD30着色的评估。 

检测问题

从方法学来说，免疫组化检测出现问题的可能因素有：对染色模式不了解、阳性及阴性对照的应用不合理、所用试剂或设备改变、所用抗体覆盖面不足、所用试剂过期等。不过，本文原作者表示，针对CD30的检测并无标准化校对品、无标准化外部验证方案，病理医师也深受其害；而这样的标准化会有助于实验室校正其CD30免疫组化步骤，并提高检测的准确性。类似的，目前也没有可追溯至关键临床结果的标准化参照组织。这些问题都妨碍了CD30免疫组化的标准化。值得庆幸的是，对于诸如间变性大细胞淋巴瘤和经典型霍奇金淋巴瘤这样的病种来说，CD30表达的水平较高，由此可以让实验室在相关检测性能方面达到极为接近的程度。

影响免疫组化结果的技术因素更是非常多。最常见技术问题与组织处理和抗原修复有关。不过，其他比较重要（且常被忽视）的问题还有脱钙对抗原的影响、内源酶（过氧化物酶）活性、亲和素与内源性生物素的不恰当结合、CD30抗体不同克隆及显色剂、检测系统的差异等。实验室对上述问题的处理一定会影响免疫组化染色质量、并最终影响诊断的准确性。尽管自动染色和标准化组织处理已成为免疫组化检测中的常规，但临床实验室必须考虑到相关局限性并理解，且对免疫组化相关问题进行验证，以确保相关结果可靠。

实验室免疫组化检测中所用抗体大部分是分析物特异性试剂（analyte-specific reagents），属于美国食品药品监督管理局规定为1类体外诊断（in vitro diagnostic，IVD）试剂。另一方面，2类或3类体外诊断用试剂盒或系统，则需使用的实验室按照制造商设计的方法精确、精准的进行相关检测。CD30抗体克隆号及生产商众多，具体可能也会影响相关检测的结果。由于CD30免疫组化检测的结果可能对患者的相应靶向治疗直接产生影响，因此如果相关检测无法做到最优化，也要考虑必要时更换抗体。

解读问题

免疫组化染色结果的解读，主要取决于组织处理及所用染色方法；结果解读中需要考虑的其他问题还有：

1. 挤压的细胞常出现非特异性着色；

2. 坏死和凋亡的细胞常因氧化酶的存在而有假阳性着色；

3. 组织固定不均常影响着色并导致同一组织切片中着色的性质和着色数量之间有差异；

4. 同一患者的蕈样肉芽肿，不同病变之间CD30的表达可能有差异，甚至同一病变本身也可能存在CD30的表达差异；

5. 不同的专业病理医师之间对CD30表达的解读也会有差异。有研究表明，蕈样肉芽肿和Sezary综合征病例中，43%的会存在CD30解读的差异。

病理医师的肉眼评估本就会有差异，制定相关病例的评估指南有助于将这一问题最小化，如具体规定评估的细胞类型（是肿瘤细胞、还是所有细胞）、相关比例（以10%为界）、可以视为阳性的着色模式。不过，即使这样做，评分一致性也仍然存在问题。更为激进的，以后可以考虑图像信息学技术上的蛋白定量分析。

CD30的NordiQC质控

北欧免疫组化质控中心（NordiQC）是独立于经济和政治之外的欧洲专业学术团体，其目的在于通过周期性免疫组化能力验证并提供参考方案、组织对照、其他相关信息（如抗原表位的描述、技术操作的参数）从而推进免疫组化流程的标准化和实验条件的优化、推广其临床应用。

十余年来，NordiQC质控关于CD30评估的能力验证已经进行了5轮（2004-2017年数据），结果表明进行CD30免疫组化检测的比例是稳步下降的：2004年是92%，2017年只有82%的实验室得到了充分的标记。

2015年的验证中，相当多的实验室因着色不足而未能通过检测，一般是因为着色弱、或完全假阴性结果。有鉴于此，本文原作者结合NordiQC质控相关建议提出了改善CD30检测的相关建议和指南。

针对免疫组化CD30评估中的检测前因素，具体建议如下：

1. 含锌固定液及B5固定液可影响CD30免疫组化结果；建议用福尔马林固定液；

2. 组织应采用10%的中性缓冲福尔马林固定液、至少固定8小时；固定时间超过24小时则可能固定过度；

3. 理想状态下，推荐采用切除活检以确保有足够的组织来进行形态学评估和分子检测；粗针穿刺活检也是可以接受的；细针穿刺活检组织可能标本不足、无法得出准确诊断及分型；细针穿刺标本所做细胞块中CD30免疫组化结果的解读尚无标准化方案；

4. 应告知临床医师标本不足或不合适的情况，并告知其原因。

针对免疫组化CD30评估中的检测因素，具体建议如下（参考了NordiQC质控）：

1. 染色不足的最常见原因，是热修复不足（加热时间过短、温度过低）、一抗浓度过低、所用检测系统的敏感性低；

2. 针对热修复不足，需用碱性缓冲液、或改良的低pH值缓冲液；

3. 针对一抗浓度过低，建议对一抗应仔细的验证、选择效果最好的CD30抗体；这方面较好的抗体克隆号有Ber-H2、CON6D/5、1G12、JCM182、EP154

4. CD30免疫组化的验证与校验方面：所用检测方案必须是经验证的、专门针对特异抗原的；该方案是针对特殊组织或标本类型的；同一实验室换其他经验证的检测方法、或其他实验室选择经验证的方法时，需至少25次单独组织标本校验；其中至少10个样本是靶抗原水平较高的标本，至少10个样本是靶抗原中等水平至低水平的标本，至少5个样本在免疫组化方面无靶抗原证据；鉴于免疫组化检测的复杂性与日俱增，建议需用更大数量的标本进行免疫组化检测校验。

针对免疫组化CD30检测的敏感性问题，具体建议如下（参考了NordiQC质控）

1. 选择恰当的对照组织极为关键：CD30免疫组化检测中，推荐用扁桃体做阳性组织对照；部分淋巴瘤的CD30表达为中等程度至低水平；经典型霍奇金淋巴瘤标本对检测极限方面不会提供有用信息，不要用作阳性对照；经典型霍奇金淋巴瘤标本做阳性对照的话，会影响对CD30低水平表达肿瘤的评估能力；

2. 相关检测方案在滤泡间B细胞和T细胞、滤泡旁生发中心B细胞必须有弱至中等程度、但却是明确的细胞膜着色；几乎所有的其他细胞都必须是阴性；

3. 浆细胞、巨噬细胞、内皮细胞可为阳性，具体取决于所用一抗：Ber-H2者，浆细胞可着色；ICM182、IG12者内皮细胞可着色；IG12者，巨噬细胞可着色。

全文完

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往期回顾

淋巴瘤诊断中CD30检测那些事（一）

淋巴瘤诊断中CD30检测那些事（二）

淋巴瘤诊断中CD30检测那些事（三）

参考文献

Xu ML, Gabali A, Hsi ED, et al. Practical Approaches on CD30 Detection and Reporting in Lymphoma Diagnosis. Am J Surg Pathol. 2020;44(2):e1-e14.

doi:10.1097/PAS.0000000000001368