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伴有极向反转的乳头状肾肿瘤的组织形态学、免疫组化和基因组学分析

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[导读] 编译:张波

摘要 伴有向反转的乳头状肾肿瘤(Papillary renal neoplasm with reverse polarityPRNRP)是最近提出的肾脏肿瘤。其预后明显好于乳头状肾细胞癌(papillary renal cell carcinomaPRCC),且常伴有KRAS错义突变。本研究比较14PRNRP10PRCC1型(PRCC1)和PRCC2型(PRCC2)临床病理组织形态学、免疫组化和分子生物学特征。使用下一代测序(NGS)对6PRNRP3PRCC14PRCC2进行了全外显子组测序。对其余8PRNRP患者采用聚合酶链式反应(PCR)测序法进行KRAS基因突变检测。结果显示,所有PRNRP病例均为pT1N0M0,无一例复发或肿瘤相关死亡。免疫组化结果显示,PRNRPCK7EMAPAX8GATA3呈弥漫性染色,而CD10CD15AMACR呈弱染色或阴性。在14PRNRP患者中,NGSPCR检测到11KRAS错义突变,但在PRCC1PRCC2中未检测到致病性KRAS突变。NGS分析显示PRNRP中的肿瘤突变负荷低于PRCCPRNRP也未显示包括7号和17特异性染色体拷贝数异常。总之,本研究认为PRNRP是一个不同于PRCC肿瘤实体

1前言

乳头状肾细胞癌(PRCC)是肾细胞癌(RCC)的第二大常见表型。1997年,DelahuntEble首次将PRCC分为两大类,PRCC 1型(PRCC1)和PRCC 2型(PRCC2)。这一分类后来作了调整。PRCC1的特征是核级别低,嗜碱性或透明细胞质少,核不重叠。相比之下,PRCC2经常显示高级别细胞核呈假复层排列,并具有丰富的嗜酸性细胞质。这两种肿瘤显示出不同的免疫组织化学特征,并且每种肿瘤都具有特征性的染色体变异,例如,PRCC 17号和17号染色体拷贝数增加。2016年,癌症基因组图谱(TCGA)研究小组发现,PRCC1MET突变相关,而PRCC2是具有各种遗传改变的异质性肿瘤类型,如CDKN2A沉默,SETD2突变,TFE3融合,NRF2eARE2通路组分表达增加和CpG岛甲基化。这项研究表明,这两种肿瘤在分子遗传学上表现是不同的。

偶然间,发现了具有介于PRCC 1PRCC 2之间特征的某种类型的肾肿瘤。这些肿瘤细胞核低级别,胞浆丰富嗜酸性,细胞核单层线状排列于乳头面,无假分层排列及核重叠。在多项研究中,该肿瘤被称为嗜酸细胞PRCC”嗜酸细胞PRCC”。在一些报告中,该肿瘤被描述为具有7号或17号染色体三体或Y染色体缺失。从这些结果来看,近20年来,嗜酸细胞PRCC”一直被认为是PRCC的一种变异实体。该肿瘤在WHO蓝皮书中也被称为嗜酸细胞性PRCC”2017年,Saleeb等人将PRCC细分为4。其中,一个肿瘤亚群“PRCC4/嗜酸细胞低度变异体显示出与嗜酸细胞PRCC相似的形态学模式,并以特异性GATA 3免疫反应性为特征。

2019年,Al-Obaidy等人首次使用术语伴有向反转的乳头状肾肿瘤PRNRP),并提出应将其与PRCC 1PRCC 2区分开来。他们将PRNRP描述为一种具有稀疏分支乳头或罕见的管状结构和嗜酸性肿瘤细胞,具有位于乳头表面顶部的低(ISUP)级细胞核,较少见泡沫状组织细胞簇和砂体。此外,同年,Al-Obaidy等报道PRNRP常见KRAS基因突变。随后,其他研究组基于该肿瘤极其惰性的生物学行为,乳头状肾肿瘤,而不是乳头状肾细胞癌。一些研究者也报道了KRAS基因频繁突变的遗传学分析。

尽管先后发表了一些关于PRNRP的论文,但由于PRNRP的罕见性,其许多特征仍不清楚。本研究利用全外显子组测序技术,从临床病理特征组织形态学、免疫组化和分子生物学角度对PRNRPPRCC 1/PRCC 2进行比较分析,并进一步展开对PRNRP认识

2材料与方法

2.1.患者和样本

从五家医院手术切除的肾癌标本中,共2820例福尔马林固定石蜡包埋标本,收集163例肾癌标本,检出14PRNRP。同时选取PRCC1PRCC210例典型病例作为对照组。PRCC1的定义是低核级别(ISUP/WHO核级别12),胞浆稀少嗜碱性,核不重叠。PRCC2的定义是高级别核(ISUP/WHO2级或3)和丰富的嗜酸性细胞质,核重叠。组织学回顾基于苏木精(HE)染色的光镜检查,以及三位病理学家独立盲法评估HE片。

对患者的临床特征,包括有无透析,手术时的年龄,性别,病理TNM分期(第八版; T1 a-T 4NXN 0N1M0M1),以及PRNRP的组织学特征进行了检查。

2.2.免疫组织化学分析

使用4 mm厚的FFPE肿瘤组织切片进行CK7EMACD10CD15AMACRPAX 8GATA 3的免疫组织化学分析。除CD15染色外,切片均采用聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(CK7)、柠檬酸钠(EMACD10)、乙二胺四乙酸(AMACR)或抗原修复液(PAX8GATA 3)进行预处理。一级单克隆抗体和这些染色模式列于表1中。结果根据肿瘤比例评分(TPS)确定,定义TPS >50%为阳性。

1.关于一抗的详细信息

伴有极向反转的乳头状肾肿瘤的组织形态学、免疫组化和基因组学分析 

2.3.下一代测序和数据分析

对于PRNRPPRCC之间的遗传比较,通过下一代测序(NGS)进行肿瘤和正常肾脏DNA的全外显子组测序。所选病例为6PRNRP病例、3PRCC 1病例和4PRCC 2病例,所有病例均在2013年后进行了手术切除。根据制造商的说明书,使用固相可逆固定法(FormaPure DNA试剂盒; Beckman Coulter)从10 mm厚的石蜡包埋组织中分别提取来自肿瘤和正常肾的基因组DNA。使用FastQC 0.11.7版(Babraham BioinformaticsUK)评价DNA的质量和数量,并使用Cell Innovator Inc.Trimmomatic 0.38版进行修剪。使用SureSelect XTAgilent Technologies)通过随机DNA片段化和扩增制备测序文库。富集的DNANovaSeq 6000IlluminaInc)上测序。委托Macrogen Inc进行文库构建和DNA测序。将序列数据与hgl 9/GRCh 37人参考基因组进行比对。Samtools 1.9bcftools 1.9用于变体调用和读段映射。

通过去除从配对的正常肾组织中获得的突变数据,更准确地鉴定了体细胞单核苷酸变体(SNV)和小插入和缺失(indels)。选择包括错义和无义(终止获得)突变的非同义SNV以及可能影响基因剪接的SNV(剪接变体)。使用Ensembl变体效应预测器(VEP91.0版注释这些体细胞改变。挑选VEP分类为致病性可能致病性的突变,然后使用Integrative Genomics Viewer手动策划。

使用VarScan 2.3.8版计算每个病例的肿瘤突变负荷(TMB)。参考癌症体细胞突变目录数据库、常见dbSNP数据库、ExAC数据库和体细胞-种系/接合性算法,过滤出常见和种系变体。随后,确定具有肿瘤变体等位基因分数(VAF> 20%、正常VAF<5%和体细胞P<0.07的高置信度变体的子集。此外,使用Revigohttp//revigo.irb.hr/)进行基因本体(GO)分析和使用CNVkithttps//www.example.com en/stable/)进行拷贝数改变(CNA)分析。由Cell Innovator Inc进行TMB计算、GO分析和CNA分析

2.4.通过聚合酶链反应进行KRAS突变分析

通过聚合酶链反应(PCR)测序对其余未接受NGSPRNRP病例进行KRAS突变分析。为此,与NGS相同地提取基因组DNA。使用以下引物检查KRAS外显子2的突变热点:正向5´-GGTACTGGTGGAGTATTTGATAG 3´和反向5´-CTGTATCGTCAAGGCACTCTTG-3´PCR反应在热循环仪(Tgradient; Biometra,德国)中进行。然后,使用FastGene Gel/PCR Extraction KitNippon Genetics CoJapan)纯化扩增的PCR产物,并且还使用ABI 3500 xl遗传分析仪(Applied BiosystemsFoster CityCA)通过直接测序进行评价。使用FinchTV 1.4.0分析测序结果。

2.5.统计分析

   使用JMP统计发现软件(版本14.0; SASCaryNC)进行统计分析。采用Wilcoxon检验对PRNRPPRCC之间的差异进行比较。显著性定义为P < 0.05。使用KaplaneMeier方法通过使用Wilcoxon检验比较KaplaneMeier曲线来分析总生存期(OS)。OS定义为从手术至末次随访或因原发性肾肿瘤死亡的时间。

3结果

3.1.临床病理特征

14PRNRP病例(病例1-14)的临床特征见表2。在14例病例中,有3例进行了血液透析。患者中位年龄为68.1岁(范围:47 e82; 6例患者(42.9%)为男性,8例患者(57.1%)为女性。所有病例均无临床症状,均为影像学检查偶然发现。肿瘤大小为1.0 ~ 5.0 cm,根据第八版TNM分期系统,除1例外,所有肿瘤均为pT 1aN 0 M0(仅例8pT 1bN 0 M0)。

术后随访期间,PRNRP病例无复发、转移或肿瘤相关死亡

 PRNRP组织形态学特征总结于表2中,并显示于图1AeF中。如前所述,所有病例均表现为乳头状结构为主(图1A),并有丰富的嗜酸性细胞质和圆形级别低的空泡状核,核仁不明显(图1B)。肿瘤细胞位于乳头面,排列(图1B)。在两个病例中(病例57),肿瘤细胞局灶性地具有透明的胞浆(图1C)。在9个肿瘤中偶见纤维血管心的间质水肿(图1D)。在3例病例中,间质中有少量泡沫状组织细胞(图1E)。10例肿瘤有纤维包膜(图1F),但无包膜侵犯14例肿瘤均无砂体、微血管浸润或肿瘤坏死。PRNRP的这些病理学特征不类似于典型的PRCC1(图1G)或PRCC2(图1H)。

 

2伴有极向反转的乳头状肾肿瘤临床病理总结

伴有极向反转的乳头状肾肿瘤的组织形态学、免疫组化和基因组学分析

伴有极向反转的乳头状肾肿瘤的组织形态学、免疫组化和基因组学分析 

1 PRNRPPRCC的组织学特征。PRNRP显示主要乳头状结构(A),并具有丰富的嗜酸性细胞质和圆形低级别空泡状核,核仁不明显,位于乳头的面,无核假层(B)。PRNRP局灶性含有透明细胞质(C)。纤维血管心偶见间质水肿(D)。在基质中观察到少量泡沫状组织细胞(E)。PRNRP有纤维包膜,但无包膜外延伸(F)。PRCC 1的特征是低核级别、嗜碱性细胞质和不重叠的核(G)。PRCC2的特征在于高级别细胞核的假层和丰富的嗜酸性细胞质(H)。

3伴有极向反转的乳头状肾肿瘤的免疫组化和KRAS突变分析结果

伴有极向反转的乳头状肾肿瘤的组织形态学、免疫组化和基因组学分析 

伴有极向反转的乳头状肾肿瘤的组织形态学、免疫组化和基因组学分析 

3.2.免疫组化结果

PRNRP的免疫组织化学结果总结见表3和图2A-D。所有肿瘤均表现出CK 7(图2A)、EMAPAX 8的弥漫性和强染色。GATA 3显示弥漫性和中度至强染色(图2B)。相比之下,14例中的13例完全为CD 10阴性,第14例显示局灶性CD 10染色(病例6;2C)。CD 15始终为阴性。14例中的8例显示弥漫性AMACR染色,尽管肿瘤细胞的强度弱于非肿瘤区域的肾小管(图2D)。

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2 PRNRP的免疫组化图谱。肿瘤细胞对CK7A)和GATA 3B)呈弥漫性阳性,但对CD 10C)呈阴性或局灶性阳性。与正常肾小管(D,插图)相比,AMACR显示弱反应(D)。

PRNRPPRCC 1/PRCC 2之间的比较总结在表4中。PRNRPPRCC 2之间CK 7EMACD 15存在显著差异。此外,在PRNRPPRCC 1之间以及PRNRPPRCC 2之间观察到GATA 3CD 10AMACR的显著差异。

4伴有极向反转的乳头状肾肿瘤(PRNRP)与乳头状肾细胞癌(PRCC)的免疫组化特征比较。

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3.3.PRNRPPRCC遗传分析比较

通过全外显子组测序检测的致病基因突变如图3所示。NGS发现6PRNRP中有4例存在KRAS错义突变。下面列出了详细的KRAS突变类型。在PRNRP中发现的其他突变包括BRIP1无义突变(c.2392C > Tp.Arg798Ter)、RAD 50无义突变(c.3229C > Tp.Arg1077Ter)和BRCA 2无义突变(c.2677C > Tp.Gln893Ter)。PRCC 11例发生MET错义突变(c.3334C > Tp.His1112Tyr)。PRCC 21例存在NF 2无义突变(c.169C > Tp.Arg57Ter),2例存在SET D2无义突变(c.4792C > Tp.Arg1598Terc.4774C > Tp.Arg1592Ter)。此外,PRNRPPRCC 1/PRCC 2没有共同的基因改变。

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3 6PRNRP3PRCC14PRCC2病例的下一代测序结果。在6PRNRP病例中的4例中检测到KRAS错义突变,而在PRCC1PRCC2中没有KRAS突变。

PRNRP中富集的术语与O-聚糖加工、化学刺激的检测、蛋白定位、钙依赖性细胞粘附和单次受精相关。PRCC 1PRCC 2中也观察到前两组,但每个肿瘤中的个体富集项不同

3.4.PRNRPPRCC之间的TMB分析

计算每个肿瘤的TMB。在PRNRP中,每兆碱基对(/MB)的突变范围为1.730.7(平均值:6.9)。在6例病例中的5例中,TMB小于3.3个突变/MB(范围1.7-3.3),而缺乏KRAS突变的第6例病例(病例13)具有30.7个突变/MBPRNRPTMB显著低于PRCC 126.5-204.2,平均值:101.7个突变/MB)和PRCC 26.2-150.3,平均值:64.2/MB;4)。

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4 PRNRPPRCC之间的TMB比较。PRNRPTMB显著低于PRCC1PRCC2

3.5.PRNRPPRCC 1PRCC 2组中检测到的全基因组CNAs

伴有极向反转的乳头状肾肿瘤的组织形态学、免疫组化和基因组学分析 

5拷贝数改变的全基因组视图。所有染色体都是彩色编码的,轨迹由点组成,这些点是计算的拷贝数。PRNRPPRCC1PRCC2相比显示出一致的模式,并且缺乏特异性染色体异常,包括7号和17号染色体的获得。

5中描述了每个肿瘤组(PRNRPPRCC 1PRCC 2)中的染色体CNAs。与PRCC1PRCC2相比,PRNRP病例的6个样本显示出一致的模式。1例仅14号染色体丢失,其他PRNRP病例均未见明显染色体异常,包括7号和17号染色体的获得。在PRCC 1PRCC 2中,7号和17号染色体的获得14号染色体的丢失更为常见。PRCC 2例中45q91315号染色体局部缺失。

3.6.PRNRPKRAS基因突变的评估

通过NGS检测的KRAS基因突变描述于图6中。其中3个涉及c.35G > Tp.Gly12ValG12 V),另一个涉及c.34G > Cp.Gly12ArgG12 R)。通过PCR测序分析的8PRNRP病例中,有7例也检测到KRAS基因突变。这些KRAS突变类型为G12 V4例)、G12 D2例)和G12 C1;7)。14例病例中共有11例(78.6%)含有KRAS外显子2错义突变(表3

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6在四个PRNRP病例中鉴定的KRAS错义突变的Integrative Genomics Viewer快照。3例显示p.Gly12ValG12V),1例显示p.Gly12ArgG12R)。

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7 PRNRPKRAS热点突变的PCR测序。G12 V4例)、G12 D2例)和G12 C1例)。

4.讨论

Al-Obaidy等人首次使用伴有极向反转的乳头状肾肿瘤这一术语,在此之前这类肿瘤被描述为所谓的嗜酸细胞型细胞各种文章相继发表。在这些文章中,嗜酸细胞PRCC”被报道表现出广泛的形态、免疫组织化学特征和预后差异。例如,许多嗜酸细胞PRCC”的预后良好,而少数侵袭性病例,如伴有肉瘤样变和脑或骨转移的病例也有报道。然而,本研究回顾了这些文章,同时考虑到PRNRP及其模拟物的形态特征,并注意到这些文章中显示的几种肿瘤似乎不是纯粹的PRNRP,而是它的模拟物。在研究中成功地排除了这些模拟物,并可以识别PRNRP的纯病例。

163例肾乳头状肿瘤中发现14PRNRP8.6%)。在最近的文献中,已经报道了大约80PRNRP病例,这表明PRNRP的罕见性。所有病例均为低TNM分期,随访结果显示预后良好,无复发、转移及肿瘤相关死亡。组织学上,PRNRP表现出统一的形态学模式,细胞学或结构多态性不明显。

PRNRP很少与泡沫状组织细胞和砂粒体相关,通常在PRCC1PRCC2观察到。许多PRNRP病例有纤维包膜,没有组织学发现提示具有高度恶性肿瘤的特征,如包膜外延伸、显微镜下血管浸润或肿瘤坏死。虽然嗜酸性细胞质的存在在组织学上与PRCC 2相似,但基于核特征,PRNRP被认为是低级别肿瘤,并提供了临床随访数据。根据这些结果和过去的文献,我们支持将该肿瘤命名为乳头状肾肿瘤而不是乳头状肾细胞癌。然而,由于随访时间有限,不能完全排除该肿瘤为低度恶性肿瘤的可能性。

免疫组织化学分析显示,所有PRNRP病例均有CK7EMAGATA3的弥漫性表达,而CD10CD15AMACR表达较少或弱于PRCC1PRCC2。在以前的报道中,除了CK7EMAGATA3外,PRNRP还显示出弥漫性的LCAM表达。Tong等人的研究成果显示在远小管中发现了CK7EMAGATA3L1CAM的染色,并推测PRNRP可能起源于远小管。作为近曲小管的标记物CD10CD15AMACR的阴性或局灶性表达,也支持这一假设。

NGSPCR测序结果显示PRNRPKRAS错义突变频率较高(11/1478.6%G12 V7/1163.6%)、G12 D2/1118.1%)、G12 C1/119%)和G12 R1/119%)。在先前的研究中,PRNRP病例中观察到热点密码子12这四种KRAS突变,发生率为80%90% 。相反,KRAS突变在RCC中很少检测到。只有Raspollini等人记录了一例具有KRAS突变的RCC病例。一些先前的研究报道透明细胞RCCPRCC和嫌色细胞RCC缺乏KRAS突变。在TCGA数据集中,5个具有KRAS突变的肿瘤被登记为PRCCAl-Obaidy等人,Kim等人,和Tong等独立地回顾了这些肿瘤,并得出结论,其中两个或三个肿瘤非常类似PRNRP

PRNRPTMB显著低于PRCC 1PRCC 26PRNRP5TMB<3.3/MB,而6KRAS突变缺失者TMB<30.7/MB。在前面提到的TCGA分析中,三个疑似PRNRP并具有KRAS突变的肿瘤中的TMB也很低(20突变)。提示KRAS突变是PRNRP的主要基因之一

PRNRP中观察到的其他体细胞突变BRIP 1RAD 50BRCA 2中所有病例均未发现KRAS突变。这些基因在DNA修复中发挥重要作用,其中的种系突变与家族性卵巢癌和乳腺癌有关。Al-Obaidy等人还在两例PRNRP病例中发现了BRCA 2突变和基因重复。然而考虑到PRNRPTMB低,这些DNA修复基因的突变是否会导致肿瘤的发生是值得怀疑的。在PRNRP中未检测到在PRCC1PRCC2中观察到的突变,包括METNF2SETD2中的突变。GO富集分析也揭示了PRNRPPRCC1/2的遗传差异。

PRNRP还表现出与PRCC 1PRCC 2一致不同的染色体模式,这也支持PRNRPPRCC之间的遗传差异。7号和17号染色体的获得被认为与PRNRP有关,但在这项研究中无法检测到这些特定的染色体异常。在过去的研究中,通过荧光原位杂交(FISH)观察到PRNRP中的7号和17号染色体三体。另一方面,在终末期肾病的非肿瘤性肾小管上皮中检测到这些染色体获得,并且以往FISH分析可能不能反映肿瘤细胞中的真实CNAs。在1PRNRP病例和一些PRCC病例中观察到的14号染色体缺失可以在其他肾脏肿瘤中发现,例如透明细胞RCC、集合管癌或肾嗜酸细胞瘤。在透明细胞肾细胞癌中,14号染色体q缺失通过缺氧诱导因子1a信使RNA和蛋白质的减少与不良临床结局相关;然而,14号染色体缺失在其他肾肿瘤中的预后影响仍然未知

PRNRP的生物学行为也可能与肾乳头状腺瘤不同。在形态学上,乳头状腺瘤的肿瘤细胞缺乏嗜碱性细胞质和低级别细胞核,免疫组化强烈表达AMACR ,这些特征类似于PRCC1而不是PRNRP。乳头状腺瘤的染色体畸变的特征是7号和17号染色体的三体性以及Y染色体的缺失,这在PRCC 1观察到。基于这些事实,乳头状腺瘤被认为是PRCC的前驱病变。与此相反,乳头状腺瘤中GATA 3表达或KRAS基因突变尚未得到全面研究,PRNRP与乳头状腺瘤的关系有待于进一步分析。

总之,PRNRP的特点是单一的形态模式。在免疫组化分析中,PRNRP显示远曲小管标记物而非近曲小管标记物的弥漫性表达。PRNRPPRCC的区别在于KRAS突变频繁、TMB低和缺乏特异性染色体异常。根据这些结果,PRNRP应被分类为肾肿瘤的一个独特的子集,并被认为是不同于特别高级别的PRCC2。如果将来检测到进一步的证据,PRNRP可能会成为一个具有良性行为的独特实体。


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