摘要

目的：原发性纵隔生殖细胞肿瘤（PMGCT）罕见，活检小样本可能诊断困难。本研究试图研发一种诊断程序，使用免疫组化染色，重点是新的标记物和等臂染色体12 p [i（12 p）]的分子分析。方法与结果：对32例纵隔肿瘤石蜡包埋组织进行SALL 4）、LIN 28、OCT 3/4、D2-40、CD 117）、SOX 17、SOX 2、CD30、β-hCG、GATA 3、FOXA 2、GPC 3、AFP、TdT、NUT和pCK染色。采用RT-PCR检测i（12 p）的分子情况。包括15例精原细胞瘤，7例畸胎瘤，1例卵黄囊瘤，1例绒毛膜癌和7例混合型PMGCT。不同实体肿瘤具有不同的免疫组化染色模式：OCT 3/4，D2-40，CD 117和TdT用于诊断精原细胞瘤; OCT 3/4和SOX 2用于提示胚胎性癌; FOXA 2，GPC 3和AFP用于诊断卵黄囊瘤;和β-hCG和GATA 3用于提示绒毛膜癌。成熟畸胎瘤上皮成分中的PCK染色阳性，SALL 4、SOX 2、GATA 3、D2-40和FOXA 2局部染色阳性。此外，诊断出1例类似PMGCT的NUT癌，显示出SOX 2强的核染色和NUT斑点状核染色。27例PMGCT中24例（89%）检测到i（12 p）。结论：活检小样本明确诊断PMGCT非常重要，除了形态学特征之外，通常还需要3-4种抗体组合来鉴定正确的组织学亚型。i（12p）分子检测也是提示生殖细胞来源的重要指标。

结果

32例（3女29男）原发性纵隔肿瘤，年龄9 ~ 69岁，平均34.25岁。共18例SEM（56.3%），其中3例为混合型PMGCT，EC混合比例较小（分别约为5%和15%）；7例成熟TER（21.9%）（2例青春期前和5例青春期后）；2例CC（6.3%），其中1例为混合型PMGCT，EC混合比例较小（约5%）；1例YST（3.2%）。此外，还检测到3例混合型PMGCT（9.4%），由两种以上亚型组成（表1）。此外，1例最初考虑PMGCT被证明是NUT癌。被研究肿瘤的免疫组织化学染色表达模式总结见（表2）。

表1.原发性纵隔肿瘤的组织学亚型及其12 p [i（12 p）]染色体情况

CC：绒毛膜癌; EC，胚胎癌; mTER，成熟畸胎瘤; NSGCT，非精原细胞瘤性生殖细胞肿瘤; PMGCT，原发性纵隔生殖细胞肿瘤; SEM，精原细胞瘤; YST，卵黄囊瘤;Mixed PMGCT混合型生殖细胞肿瘤;NUT carcinoma，NUT癌。

*由于技术问题，定量实时聚合酶链反应在某些情况下不可行。

表2.原发性纵隔生殖细胞肿瘤成分的免疫组织化学染色模式[n（%）]

* 由于技术问题，并非所有病例都能染色。†点状膜或核周染色。‡16例阳性病例中4例为单个细胞表达。§仅在一些上皮结构中有阳性。¶在肠分化组织（例如胰腺腺泡和肠粘膜）中FOXA 2阳性。** 仅在一小部分肿瘤细胞中呈阳性。

组织学和免疫组织化学特征

原发性纵隔精原细胞瘤（SEM）

SEM由中等大小的多边形细胞组成，具有片状或索状生长模式。纤细的纤维间隔将肿瘤细胞分成小叶。肿瘤细胞边界清晰，透明至淡染或轻度嗜酸性细胞质，以及偏心细胞核，具有一个或多个突出的核仁（图1A）。19例中有6例（31.6%）可见非坏死性肉芽肿性炎症，包括上皮样组织细胞和罕见的朗汉斯型多核巨细胞（图1B），可检测到淋巴细胞浸润和小面积坏死。

在所有情况下，几乎所有SEM细胞均显示出强的细胞核SALL 4染色（图1C）和弱的细胞质LIN 28染色（图1D）。OCT 3/4显示出强核染色（图1 E），D2-40显示出强膜染色（图1F）。CD 117显示较弱的膜染色。在19例病例中的14例（73%）中，大多数肿瘤细胞显示出比OCT 3/4稍弱的SOX 17核染色（图1G）。在14例（73%）中，存在PCK的点状染色（图1H）。此外，有5例（26.3%）有单个β-HCG阳性合体滋养层细胞（图1 I）。此外，19例SEM成分中有16例（84.2%）显示TdT染色阳性，12例样本（63.2%）的细胞核染色较强（图1 J）。

原发性纵隔胚胎性癌（EC）

混合型PMGCT中EC细胞检出率为87.5%。本研究中只有1例（12.5%）通过组织形态学直接诊断为EC，瘤细胞胞质淡染、细胞核中等大小、核突出仁，排列呈腺样或柱状结构。其他病例均通过免疫组化确诊，OCT 3/4（100%）、SOX 2（100%）和CD 30（71.4%）呈阳性（图1 K，L）。在混合型PMGCT中分别有5%、15%和20%的肿瘤细胞发现了该三种抗体标志物组合阳性（表1）。所有病例瘤细胞也表达SALL 4（100%）和LIN 28（100%）。

原发性纵隔卵黄囊瘤（YST）

本研究检测到1例单纯原发性纵隔YST和3例混合原发性纵隔YST（表1）。混合YST为微囊和内胚窦模式，而纯YST主要表现为实性生长模式，只有小微囊区。实性区域被纤维间隔和嗜酸性基底膜分割（图2A、B），伴有局灶性坏死。肿瘤细胞呈立方形至多边形，胞质稀少。细胞核呈卵圆形，核膜不规则，含有一个或多个显著的嗜酸性核仁和病理性核分裂。此外，实性模式YST含有一些散在的瘤巨细胞和单个多核肿瘤细胞。

所有四种情况下的YST组分对干细胞标志物SALL 4（100%）（图2C）和LIN 28（100%）呈阳性。此外，所有四种情况下的每个细胞都显示出F0XA 2的强核染色（100%）和GPC 3的胞质染色（100%）（图2D，E）和PCK（100%）。实性模式的YST含有非常少的AFP阳性细胞（图2F），而所有混合型PMGCT中的YST组分显示出强烈的AFP阳性细胞（图2F）。YST中所有类型的细胞均为β-hCG阴性。此外，其中一种混合型PMGCT中的YST组分70%的肿瘤细胞中显示出GATA 3的强核染色，在约50%的肿瘤细胞中显示出SOX 17的弥漫染色。

图1.原发性纵隔精原细胞瘤（SEM）。A,中等大小的肿瘤细胞，细胞质稀少，核明显偏心。B，显著的淋巴细胞浸润和肉芽肿性炎症，伴上皮样细胞肉芽肿形成。C、D，SALL 4强核染色和LIN 28阳性。E、F，OCT3/4和D2-40阳性。G，SOX 17阳性。H，纵隔SEM细胞中CK的点状阳性。I，β-hCG阳性。J，SEM细胞中的强核TdT染色。K，L，SOX 2和CD 30的散在单细胞染色，类似胚胎癌细胞。

图2.原发性纵隔卵黄囊瘤（YST）。A、B，YST伴实性生长模式和纤维间隔，以及重度异型性和多核瘤巨细胞。C，所有大小的肿瘤细胞显示SALL 4染色。D、E，几乎所有肿瘤细胞显示FOXA 2染色和GPC染色。F，实体生长模式的YST下，仅少数肿瘤细胞呈AFP单细胞阳性。

原发性纵隔CC

2例纵隔CC（一种纯CC，一种与EC混合）均显示丛状或实体生长模式，由三种不同的细胞类型组成，包括细胞滋养细胞、中间滋养细胞和合体滋养细胞（图3A）。合体滋养细胞为巨细胞，多形核，深染，胞浆浓嗜酸性，位于滋养细胞之间，多角形，核圆形，核仁突出。所有细胞类型均显示出强的核SALL 4染色，但仅在一些细胞滋养细胞中显示出较弱的细胞质LIN 28染色（图3B、C）。β-hCG在所有肿瘤细胞中显示阳性，GATA 3在大多数细胞中显示强核染色，并且PCK在所有肿瘤细胞中显示强阳性（100%）（图3D-F）。在1例病例中，仅在部分细胞中观察到GPC 3染色。

图3.原发性纵隔绒毛膜癌（CC）。A,瘤细胞实性片状，细纤维间隔分割，由细胞滋养细胞、中间滋养细胞和合体滋养细胞组成。B,核SALL 4强染色。C，除中间滋养细胞和合体滋养细胞外，一些细胞滋养细胞中存在弱的LIN 28染色。D,β-hCG在所有细胞类型中均检测到，尤其在合体滋养细胞中。E,GATA 3在大多数细胞中呈核阳性表达。F,CC细胞显示出CK的强膜染色。

原发性纵隔TER

本研究检测到2例青春期前和5例青春期后成熟的TER，和2例混合型PMGCT具有成熟性畸胎瘤成分。在组织学上，所有病例均显示两个或三个胚层，包括表皮组织、真皮附属器、支气管粘膜、腺体和软骨、胃肠粘膜、平滑肌细胞和外分泌胰腺组织（图4A-D）。

成熟TER唯一的免疫组化标记物显示一致阳性是CK在上皮细胞表达。5/9例（55.5%）在胰腺腺泡或肠粘膜上皮细胞中观察到阳性细胞核FOXA 2染色。3/9病例（33.3%）在上皮中显示弱的细胞核SALL 4染色和弱的细胞质LIN 28染色（图4 E、F）。另外5/9病例（55.5%）在上皮结构和淋巴管中显示D2-40染色，并且6/9病例（66.6%）还在上皮结构中显示中度核S0X 2染色（图4G）。一些病例还显示GATA 3（22.2%）、β-hCG（11.1%）和GPC 3（44.4%）阳性（图4 H，I）。

图4.原发性纵隔成熟畸胎瘤。A,表皮和真皮组织及真皮附件。B,胰腺组织及导管和腺泡。C、呼吸上皮、浆液粘液腺和透明软骨。D,肠上皮细胞、杯状细胞、Paneth细胞和上皮下淋巴细胞。E-H，一些上皮成分表达SALL 4（E）、LIN 28（F）、SOX 2（G）、β-hCG（H）和GATA 3呈阳性（I）。

纵隔NUT癌

肿瘤主要呈巢片状生长，可见纤维间隔，有明显的嗜中性粒细胞浸润和坏死区域。瘤细胞中等-较大，具有少量嗜碱或透明细胞质，核大、空泡状、核仁突出（图5A）。只有少数细胞显示SALL4染色（图5 B），而LIN 28为阴性。几乎所有的肿瘤细胞都显示出强的核SOX 2染色（图5C），而OCT 3/4完全阴性。由于这些结果，进行NUT染色，并且在>70%的肿瘤细胞中显示斑点状核染色（图5D）。大多数肿瘤细胞显示CK（图5E）、p40（图5 F）和p63（图5G）染色。这些结果表明是NUT癌。一些单细胞还显示出CD 30（图5 H）和β-hCG（图5 I）染色。

图5.纵隔NUT癌。A,中等大小肿瘤细胞的实性巢，胞质稀少而清晰，核仁突出，纤细的纤维分隔肿瘤细胞巢，可见明显的中性粒细胞浸润。B,一些肿瘤细胞强阳性表达的SALL 4。C,几乎所有肿瘤细胞强SOX 2核染色。D,约70%的肿瘤细胞斑驳表达核NUT染色，这是NUT癌的特征。E,部分强CK膜染色。F、G,多数肿瘤细胞核p40、p63染色阳性。H,肿瘤内的小灶显示CD 30膜染色。Ⅰ,少数细胞还表达β-hCG染色。

i（12 p）定量PCR检测

28/32例（87.5%）进行了i（12 p）定量PCR检测。由于组织量不足，4例无法进行研究。24/27例（89%）检测到i（12 p）（表1）。i（12 p）阴性病例包括3例PMGCT（1例SEM和2例青春期前纵隔TER）和NUT癌。

PMGCT的诊断程序

纵隔肿瘤性病变患者血清肿瘤标志物AFP或人β-hCG水平显著升高表明存在PMGCT。如果需要活检才能做出正确诊断，形态学特征可存在单纯或混合型PMGCT的诊断。在具有严重坏死区域或烧灼假象的活检中，诊断可能很困难。因此，常常需要不同的标记物组合来检测不同的PMGCT亚型。通过修改Bremmer等人建立的免疫组织化学程序，研发了PMGCT的诊断程序。本研究增加了i（12 p）的诊断特征、形态学特征和分子研究，并专注于每种类型的更特异的免疫组织化学标记物，如纵隔肿瘤具有不确定的GCT样形态学特征时，则可通过SALL 4（或另外LIN 28）的免疫染色来确认为GCO。之后，在基本明确为PMGCT的情况下，应使用OCT 3/4染色来判定SEM或EC，再通过D2-40和SOX2进一步区分SEM和EC。如本研究所示，一些SEM含有类似EC细胞的SOX 2阳性细胞。在OCT 3/4阴性肿瘤中，FOXA 2、GPC 3和AFP染色可明确YST，β-hCG染色结合GATA 3染色可确认为CC。FOXA 2是最近描述的标记物，对于含有较少的YST成分高度特异。成熟的TER通常可以根据其典型形态学进行诊断。在疑难病例中，例如未成熟的TER或疑似SMT的肿瘤，i（12 p）的分子检测有助于确认GCO。

讨论

原发性纵隔肿瘤，包括胸腺瘤、胸腺癌、淋巴瘤、软组织肿瘤、神经源性肿瘤、甲状腺肿瘤、GCT或特殊实体（如NUT癌）非常罕见，因此必须与转移肿瘤区分开来。肿瘤的正确诊断对于精准治疗和预后非常重要。PMGCT的诊断通常是根据临床特征和血清标志物水平升高，但需要排除睾丸GCT转移所致。免疫组织化学染色通常是形态学特征不确定时，需要识别所有肿瘤成分或进行亚型分型。本研究改良创建PMGCT的诊断程序，包括形态学特征，免疫组织化学和分子分析。

PMGCTS的几种类型

纵隔SEM与睾丸SEM具有相同的形态学特征，但很少显示囊性改变。如果肉芽肿性炎症突出并隐藏SEM细胞，则可能导致肉芽肿性疾病如结节病或结核病的错误诊断。 SEM可以通过OCT 3/4和另一种标志物D2-40抗体阳性来证实，由于两者都具有类似精原细胞瘤GCT亚型，因此EC也对OCT 3/4呈阳性。 D2-40对SEM比CD 117更敏感和特异，CD 117在其他纵隔肿瘤中可能呈阳性（例如胸腺癌和黑色素瘤）。此外，D2-40在血管淋巴管和间皮肿瘤中可呈阳性，或在NSGCT中显示局灶性弱阳性。此外，SOX 2和SOX 17也可用于区分SEM和EC。SOX 2是EC的最佳标记物，因为它仅在EC中表达，在SEM中被抑制。然而，SOX 17在YST中也可以呈阳性表达。不推荐使用CD 30检测纵隔EC，因为它的特异性低于SOX 2，并且在大多数流行的纵隔B细胞淋巴瘤中呈阳性（例如霍奇金淋巴瘤和原发性纵隔大B细胞淋巴瘤）。SMARCA 4缺陷型肿瘤应被视为OCT 3/4阴性、SALL 4和SOX 2阳性肿瘤的鉴别诊断。 SEM中单个β-hCG阳性细胞类似于合体滋养细胞，可导致血清β-hCG水平升高，但不应诊断为混合型PMGCT。包括本研究在内的几项研究表明，GCT或PMGCT具有较强的核TdT免疫反应性。这在纵隔活检中诊断比较困难，因为正常胸腺组织、胸腺瘤和T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病中TdT也持续阳性，故需结合其他标志物支持纵隔SEM的诊断。纵隔SEM显示CK特定点状染色模式，而睾丸SEM显示膜染色。在鉴别诊断中应认识到这一点，因为它与大多数胸腺瘤和胸腺癌强和弥漫CK染色需要鉴别开。YST显示出多种组织学模式（即微囊或大囊，腺泡，假乳头状、粘液瘤、肝样、卵黄样、肠型、实性和梭形），通常由一种以上的模式组成。 YST以实性生长模式为主需要与其他NSGCT区分开来，并且可以显示阴性AFP免疫反应性，因为AFP的灵敏度仅为60%。因此，FOXA 2和GPC 3是诊断YST较AFP敏感和特异的标志物。最近研究表明，FOXA 2在YST细胞系中的表达和在YST组织标本中的强核染色已经证明它是一种可靠的标记蛋白。此外，FOXA 2在区分YST和CC方面更具特异性，因为CC可以对GPC 3呈阳性，并且其核染色比GPC 3的细胞质染色更容易识别。然而，应进一步行β-hCG染色以识别或排除CC。如YST仅包含类似于合体滋养细胞的单个β-hCG阳性细胞，混合型PMGCT的诊断则不明确。此外，GATA 3是CC的另一个标志物，但YST也可能呈阳性GATA 3染色。因此，需要排除其他GATA 3阳性肿瘤（如乳腺癌或尿路上皮癌的转移）。总之，需要结合标记物来明确诊断YST和CC，因为两者没有特异性的独立标记物。

如果TER由成熟组织组成，则可以根据形态学容易诊断。不成熟的TER可能很难在形态上与不同的纵膈肿瘤（例如神经源性肿瘤）或不同的YST模式区分开来，这也是因为GPC 3染色呈阳性。畸胎瘤也可表现出SMT，因此类似于其他恶性肿瘤。由于许多标志物（例如FOXA 2、SALL 4、LIN 28、D2-40、SOX 2、β-hCG和GATA 3）在畸胎瘤中均可为局灶性阳性，因此诊断时必须谨慎。

GCO的确定

如果需要确定GCO，则SALL 4是最敏感的标志物，因为它在所有PMGCT亚型（不包括TER）中始终显示强核染色，这也得到了本研究的证实（表2）。然而，重要的是要考虑到，少数腺癌或其转移瘤病例和具有SMT的PMGCT可能对SALL 4也呈阳性。Cao等人表明，另一种生殖细胞标志物LIN 28对SEM和YST的敏感性与SALL 4相似，对性腺外YST的敏感性略高，但对性腺和性腺外CC的敏感性较低。这与我们的结果不完全一致，因为SALL 4阳性的病例多于LIN 28阳性的病例。因此，LIN28可用作辅助的生殖细胞标记物。

此外，i（12 p）或12 p染色体的获得是II型GCT中最重要且几乎是唯一的特异性分子改变之一。在其他实体恶性肿瘤中很少检测到，但可在无论原发部位和患有SMT的绝大多数GCT亚型中确定。由于荧光原位杂交（FISH）分析尚未广泛使用，本研究之前开发了qPCR分析来检测睾丸GCT中的i（12 p）。在89%的PMGCT中检测到i（12 p），前后研究的结果一致。此外，i（12p）检测在具有少量提取的DNA的小组织活检中也是可能的，甚至在仅具有少量存活肿瘤细胞的样品中也是可行的。Gurda等人通过FISH分析确定骶尾骨成熟TER和Kao等人描述的纵隔TER中缺乏i（12 p）。

纵隔NUT癌

最初诊断为EC的病例（病例11;表1;图5）最终诊断为NUT癌。这种侵袭性、低分化的癌伴常见的鳞状细胞分化，可以模仿其他不同的恶性肿瘤。 NUT癌通常发生在中线上皮结构（如鼻窦、气道、纵隔和膀胱），但也可发生在全身。它们通常具有平衡的t（15; 19）15号染色体上的NUT或NUTM 1与19号染色体上的BRD 4易位，导致SOX 2表达增加。本研究中，PMGCT的相似形态学特征和重叠免疫染色（SOX 2，SALL 4，CD 30和β-hCG）最初导致混淆而没有诊断为NUT癌。NUT癌的诊断可以通过特征性斑点状核NUT免疫染色来证实。SALL 4、CD 30和β-hCG的局灶性阳性在文献中尚未描述，未来的研究应更密切地关注这些发现。此外，一些GCT可以显示阳性局灶性NUT染色（<10%的肿瘤），这在本研究任何病例中都没有检测到（表4）。血清标志物（例如AFP和β-hCG）水平的轻微升高并不能排除NUT癌。因此，这两种标志物对于GCT检测的特异性和灵敏度有限，除非其标记物水平高度升高。miR 371 a-3 p是一种即将出现的血清标志物，其对所有睾丸GCT亚型（TER除外）的敏感性和特异性均高于AFP和β-hCG。

结论

本研究研发出诊断程序能够可靠地诊断PMGCT，尤其适用于活检小组织。除了形态学特征之外，通常还需要3-4种抗体的组合来进行正确的亚型分型。一些标记物必须仔细评估，因为与其他纵隔肿瘤重叠。i（12 p）分析即使在小活检样本中也可作为在选定病例中检测GCO的额外选择，qPCR也是一种有用的工具。最后，纵隔NUT癌可能是潜在的诊断陷阱，因为其与其他类型具有重叠的形态学和免疫染色，务必仔细。

点此下载原文献