摘要：遗传性平滑肌瘤病和肾细胞癌（HLRCC）是由富马酸水合酶（FH）基因的种系突变引起的肿瘤易感综合征。最常见的特征是子宫和皮肤部位的多发性平滑肌瘤。该综合征具有易患早发性侵袭性肾细胞癌的倾向。在其他子宫肌瘤患者中识别HLRCC妇女是很重要的，以便指导他们进行遗传咨询并识别其他受影响的家庭成员。材料和方法：本文进行了一项全国性的回顾性研究，以判定HLRCC相关子宫平滑肌瘤典型的临床特征，组织形态学和免疫组织化学特征。该研究包括20名具有已知FH种系突变的妇女和77名患有散发性子宫平滑肌瘤的妇女。收集43个HLRCC相关子宫平滑肌瘤和42个散发子宫平滑肌瘤标本进行组织学分析。对HE的组织切片进行形态学描述，并对CD 34、Bcl-2和p53染色进行免疫组织化学分析。结果如下：与散发性平滑肌瘤组相比，HLRCC妇女在年轻时被诊断为子宫平滑肌瘤（平均33.8岁vs45.4岁，P<0.0001），并且与散发性平滑肌瘤组相比，HLRCC妇女的平滑肌瘤以多发形式存在（88.9%vs30.8%，P<0.0001）。与散发性平滑肌瘤组相比，这些妇女接受手术治疗的年龄更小（平均37.3岁vs48.3岁，P<0.0001）。与散发性平滑肌瘤组相比，HLRCC平滑肌瘤具有更密集的微血管，CD 34免疫染色突出显示（112.6平均计数/HPF,SD20.8 vs37.4平均计数/HPF，SD21.0 P<0.0001），抗凋亡蛋白Bcl-2免疫染色较散发性平滑肌瘤组强（弱4.7%，中度44.2%，强51.2%vs26.2%，52.4%，21.4%，P=0.003）。在p53染色中未观察到差异。结论：HLRCC患者可以通过不同的临床特征来鉴别：年轻时有症状和大量的平滑肌瘤，以及FH-突变型平滑肌瘤的形态学特征，Bcl-2和CD 34免疫组化辅助。此外，区分具有种系FH突变的个体可以进行适当的遗传咨询和定期的肾脏监测。

1 引言

遗传性平滑肌瘤病与肾细胞癌（HLRCC）构成了常染色体显性肿瘤易感综合征，其特征在于多发性早发性子宫平滑肌瘤、多发性皮肤平滑肌瘤和早发性II型乳头状肾细胞癌。HLRCC是由富马酸水合酶（FH）基因中的杂合种系突变引起的，所述FH基因使FH酶失活，引起FH缺乏和改变三羧酸循环的功能。HLRCC的患病率尚不清楚，但在76%-100%的具有提示该综合征临床特征的家族中观察到致病性种系FH突变。HLRCC相关子宫平滑肌瘤在FH突变携带者中高度突出（42%-100%）。子宫切除术的高风险（40岁时为53%）突出了这种肿瘤综合征中的显著子宫疾病。皮肤肌瘤是最明显的特征（男性100%复发，女性55%在35岁时发病），而肾细胞癌（RCC）仅在一部分病例中检出（FH突变阳性家族中为20%-25%，突变携带者的估计终生风险为15%-21%）。 HLRCC-相关RCC在性质上特别具有侵袭性，远处转移率高于其他遗传性肾癌综合征。早期诊断和临床干预可改善子宫肿瘤对健康的影响;多发性和大的子宫平滑肌瘤使子宫变形，损害胚胎着床，导致复发性流产，早产，并可能阻碍分娩。在子宫肌瘤患者中识别这种遗传性肿瘤综合征的筛查方法缺乏准确性。妇科医生和病理学家在诊断该综合征中起着至关重要的作用，尽早获得HLRCC综合征的第一个提示是很重要的，因为与非HLRCC综合征的子宫平滑肌瘤相比，严重症状性子宫平滑肌瘤的发病年龄明显更年轻，已经描述了一些FH-缺陷型子宫平滑肌瘤，尽管这些特征不仅特异于单独的综合征FH突变，而且特异于HLRCC-无关的体细胞FH突变。此外，形态学的可重复性和诊断准确性对于FH-突变型平滑肌瘤还没有达到足够的灵敏度和特异性。FH的免疫组织化学（IHC），其在FH-缺陷型组织中表现为染色完全丧失，不推荐用于排除HLRCC，因为有证据表明在具有FH种系突变的子宫平滑肌瘤中保留FH染色。 FH缺陷细胞积累高水平的富马酸蛋白，其自发地与半胱氨酸巯基反应形成S-（2-琥珀酰基）半胱氨酸（2SC）。琥珀酸化蛋白可以用2SC抗体检测到，这确实可以作为FH-缺陷型子宫平滑肌瘤的生物标志物。然而，2SC抗体最近才商业化，并且由于HLRCC综合征的罕见性，很可能大多数病理学实验室没有这种抗体和染色。因此，FH-缺陷型平滑肌瘤和HLRCC综合征的确诊可能在专科中心进行，而原发性平滑肌瘤的诊断和FH-缺陷型平滑肌瘤的怀疑是在缺乏直接或间接突变状态分析的医院进行的。

本文对患有HLRCC和子宫平滑肌瘤的妇女进行了一项全国性研究，以收集大量具有详细临床信息的组织标本。目的是进行组织病理学分析，全面描述子宫肌瘤形态，以提高HLRCC患者的检测。本研究中评价的形态学特征和IHC，适用于基本妇科标本诊断的大多数病理学实验室中进行。由于形态学评价的可重复性较差，纳入了与先前报告的HLRCC平滑肌瘤中缺氧和抗凋亡途径的发现相关的IHC染色，以及一些易于识别的形态学模式，以测试它们是否在HLRCC和散发性平滑肌瘤的鉴别诊断中具有诊断价值。选择CD 34染色用于微血管密度评价。选择凋亡相关的Bcl-2和p53染色，因为它们容易获得并且在大多数病理实验室中普遍使用。此外，我们还研究了平滑肌瘤的临床特征，以进一步确定HLRCC综合征的标准。符合该肿瘤综合征标准的患者可以接受遗传咨询和FH突变检测以诊断HLRCC。

2 材料与方法

2.1患者和样本

招募芬兰所有五个临床遗传学部门HLRCC女性参与研究。最后，产生来自17个个体的43个HLRCC平滑肌瘤组织标本的数据集。散发性子宫平滑肌瘤组由欧卢大学医院妇科门诊的患者组成。来自32名妇女的42例平滑肌瘤组织标本用于组织学分析。这些妇女经历了子宫切除术或子宫肌瘤切除术，其组织样本可用于我们的分析。再次，通过2SC IHC确定双等位基因FH失活状态，2SC IHC是用于检测FH-缺陷型肿瘤的稳健生物标志物。

2.2临床特征分析

比较了17例HLRCC和32例散发病例之间的数据，以测试是否有不同的临床特征，区分HLRCC患者和散发平滑肌瘤患者。

2.3 FH状态筛选

福尔马林固定石蜡包埋的子宫平滑肌瘤组织块取自病理科。组织微阵列（TMA），包括所有收集的HLRCC相关和散发性子宫平滑肌瘤样品，在分析之前进行。为了将样本的最具代表性的区域纳入TMA中，从所有福尔马林固定石蜡包埋的组织块上切下的5 μm切片用苏木精和伊红染色，并由妇科病理学家（RB和AA）标记肿瘤区域。从原始样品块冲压出四个芯（直径0.8mm）并插入TMA石蜡块中。正常子宫肌层核心作为对照包括在TMA中。使用手动组织排列器构建TMA。

2SC抗体用于评估FH的双等位基因失活，将显示强细胞核和细胞质染色的样品评分为阳性（+），表明FH的双等位基因失活，并且将在单细胞中显示无染色或仅低细胞质阳性的样品评分为阴性（-）。

2.4 组织形态学和免疫组织化学分析

对17例HLRCC患者的43个子宫平滑肌瘤和32例无HLRCC证据的42个散发性平滑肌瘤的HE染色切片进行了回顾性分析。此外，使用一组常规诊断性IHC染色（CD 34、Bcl-2和p53）。由两名对突变状态不知情的研究者（AA和OU）评价IHC染色。由妇科病理学（AA）专业病理学家根据HE切片对细胞丰富程度构成、核非典型性/多核细胞、显著嗜酸性核仁伴核周晕、嗜酸性小球、水肿变性、玻璃样变性和有丝分裂活性进行组织学评价。有丝分裂活性从热点中的10个高倍视野（HPF）计算。微血管密度定义为每个HPF中CD 34染色阳性血管的数量。根据热点中的4个HPF计算血管，并报告每个HPF的平均血管密度。即使在HPF中观察到的部分血管也包括在计算中。将细胞核和细胞质Bcl-2染色反应分为4类：0，免疫染色阴性; 1，免疫染色弱或少于10%的细胞显示阳性; 2，免疫染色中等或10%-70%的细胞显示阳性;3，免疫染色强或超过70%的细胞显示阳性。p53结果分类为0，完全阴性免疫染色（异常）; 1，在少于75%的细胞中弱或中度核染色（野生型）;2，在至少75%的细胞中强核免疫染色（突变型）。

2.5统计分析

使用SPSS for Windows 25.0.0.0（IBM Corp）进行临床特征、形态学和IHC的统计分析。对于连续数据，HLRCC和散发病例之间差异的统计学显著性通过正态分布数据的独立样本t检验和偏斜数据的Mann-Whitney U检验进行评估。对可用于本研究的子宫肌瘤组织标本进行临床特征敏感性分析。子宫肌瘤的类型和IHC标记物和其他分类数据之间的关联使用交叉表和Pearson卡方检验和Fisher精确检验进行评估。P＜0.05被认为具有统计学显著性。给出的所有值均为频率或平均值/中位数±标准差（SD）。

3 结果

3.1临床特征

HLRCC相关子宫平滑肌瘤患者与散发性子宫平滑肌瘤患者的妇科临床特征相比有显著差异。在这项研究中，HLRCC女性被诊断为平滑肌瘤时明显比散发性平滑肌瘤组年轻（33.8岁vs45.4岁，P<0.0001）。与散发性平滑肌瘤组相比，这些患者在诊断时更常出现临床症状（95%vs6.5%，P<0.0001），月经过多（60% vs. 3.9%，P<0.0001）和下腹部疼痛（70%vs2.6%，P<0.0001）。与散发性平滑肌瘤组相比，需要连续治疗的年龄明显更小（37.3岁vs48.3岁，P<0.0001）。HLRCC患者的平滑肌瘤数目多于散发性平滑肌瘤患者（88.9%vs30.8%，P<0.0001）。平均而言，HLRCC组手术时子宫较散发性平滑肌瘤组重（438gvs367g，P= 0.6），最大平滑肌瘤直径较大（68mmvs56mm，P=0.08），但差异无统计学意义。研究组之间的生育力特征无差异（妊娠2.4vs2.0，P=0.31;分娩2.0vs1.7，P=0.33）。

3.2 组织形态学和免疫组化特征

所有43例HLRCC相关子宫肌瘤在2SC染色上均为阳性（+），所有42例散发性子宫肌瘤均为阴性（-），这证实了研究组内FH失活状态。所有子宫平滑肌瘤组织学上均为良性。HLRCC相关平滑肌瘤和散发性平滑肌瘤在细胞密度构成、核分裂活性（均为典型）、水肿变性和坏死方面的频率相似（表1）。HLRCC相关平滑肌瘤与散发性平滑肌瘤的鉴别依据是细胞核染色。（30.2%vs0，P<0.0001），显著的嗜酸性核仁伴核周晕（39.5%vs2.4%，P<0.0001）、嗜酸性小球（48.8%vs0，P<0.0001）和无玻璃样变性（2.3%vs33.3%，P<0.0001;表1，图1）。

表1.17例中43个遗传性平滑肌瘤病和肾细胞癌（HLRCC）相关子宫平滑肌瘤组织标本和32例42个散发性子宫平滑肌瘤组织标本的形态学特征

图1.散发性平滑肌瘤（A，B）和HLRCC平滑肌瘤（C-F）的形态学特征.(A)典型形态，（B）玻璃样变，（C）鹿角形血管，（D）嗜酸性核仁伴核周晕，（E，F）多核细胞

HLRCC相关子宫肌瘤微血管密度显著高于散发性子宫肌瘤（112.6个/ HPF，SD 20.8vs37.4个/HPF，SD 21.0，P<0.0001;图2）。HLRCC肌瘤的血管部分扩张，有时呈鹿角形。抗凋亡蛋白Bcl-2在HLRCC平滑肌瘤中的阳性率较高与散发性平滑肌瘤相比（分别为4.7%/44.2%/51.2%vs26.2%/52.4%/21.4%，弱/中度/强，P=0.003）（图2）。所有HLRCC和散发性平滑肌瘤标本显示弱或中度（小于75%的细胞）不连续的p53免疫染色（野生型）。

图2.散发性和HLRCC子宫平滑肌瘤的免疫组化染色结果。(A)通过CD 34抗体染色表达的微血管密度导致HLRCC子宫平滑肌瘤的每高倍视野（HPF）平均计数高于散发性子宫平滑肌瘤（平均值±SD：112.6±20.8vs37.4±21.0，P<0.0001）。(B)抗凋亡蛋白Bcl-2染色（弱免疫染色）

4 讨论

本研究结果表明，可疑的HLRCC相关平滑肌瘤可以通过不同的临床特征和组织学特征来区分。受这种肿瘤综合征影响的妇女有很高的风险发展为多发性子宫平滑肌瘤，使子宫变形相当大。平滑肌瘤是临床症状显著，并且患者需要在年轻时进行手术治疗。在组织病理学分析中，这些平滑肌瘤具有共同的形态学特征，如多核细胞、显著的嗜酸性核仁伴核周晕、嗜酸性小球、鹿角状血管和（本研究新发现）无玻璃样变。免疫组化检测CD34和Bcl-2可进一步加强对本病的诊断准确性。如果符合这些标准，建议转介遗传咨询和HLRCC（FH突变）检测。

先前的研究表明，HLRCC妇女有许多（1至20）和大（直径可达10厘米）的子宫平滑肌瘤。散发性平滑肌瘤的初步诊断通常是偶然发现，HLRCC相关的平滑肌瘤被诊断时一般具有严重症状，并且大约提前10年（30岁vs40岁）。由于子宫增大和畸形，这些女性在年轻时需要手术治疗（肌瘤切除术或子宫切除术），许多时候在30岁之前。本研究结果支持这些临床特征。

HLRCC相关子宫平滑肌瘤具有独特的肿瘤形态学，其基于（1）细胞密度增加，（2）核非典型性/多核细胞，和（3）突出的嗜酸性核仁伴核周晕，（4）嗜酸性小球，（5）水肿变性，和（6）鹿角状血管。神经鞘瘤样细胞核栅栏状结构也已被证实。本研究并未证实细胞密度增加或水肿变性是HLRCC相关平滑肌瘤的典型特征。此外，细胞核栅栏化在任何平滑肌瘤中都不是一个突出的特征。细胞核非典型性增多、显著的嗜酸性核仁、鹿角状血管和胞浆嗜酸性小球的存在与先前发表的形态学特征一致。本研究中具有异型核的HLRCC平滑肌瘤可归入WHO的“奇异核平滑肌瘤”亚组，尽管奇异细胞的数量不是很丰富。本研究还增加了没有玻璃样变的新发现作为明显差异。由于最近的一项盲法对照队列研究得出的结论是，在病理学家中形态学标准在很大程度上重复性差，因此本研究中增加了一些免疫组化染色，从而联合组织形态学和免疫组化分析提高HLRCC子宫平滑肌瘤的诊断。

HLRCC相关肿瘤的分子机制之一是所谓的“假缺氧”途径，其由缺氧诱导因子1（HIF 1 α）的诱导和缺氧/血管生成途径基因在常氧条件下的过表达引起。这被认为是FH失活的直接结果。观察到HLRCC子宫平滑肌瘤中的HIF 1 α水平高于周围子宫肌层，并且HLRCC平滑肌瘤中HIF 1 α靶基因的表达水平高于散发性平滑肌瘤。此外，HLRCC平滑肌瘤中的微血管密度高于周围子宫肌层，而散发性平滑肌瘤的血管密度低于正常子宫肌层。因此，分析血管密度有助于区分HLRCC子宫平滑肌瘤和散发性平滑肌瘤，微血管密度可通过内皮标记物（如CD 34染色）突出显示。

置于缺氧条件下的细胞最终会经历几种生物反应，凋亡是其中之一。然而，FH-失活的细胞通过激活能量传感器AMP-活化的蛋白激酶克服了不依赖于HIF机制的凋亡信号传导。在Wortham等人的研究中首次观察到对凋亡的抗性增加，他们观察到子宫平滑肌瘤组织中几种抗凋亡蛋白（Bcl-12、PCNA、Bcl-1x和Bax）的表达存在显著差异，表明存活和抗凋亡的信号更强。关于小鼠模型中肾囊肿形成的另一个观察结果是HIF途径似乎并不有助于囊肿形成，但富马酸盐积累导致通过Kelch-like ECH-CRP相关蛋白-1（KEAP 1）琥珀酰化激活抗氧化剂应答途径。KEAP 1是氧化应激传感器，其琥珀酰化导致稳定核因子类胡萝卜素2-相关因子2，其进一步诱导促进肿瘤生长的抗氧化反应途径。Bcl-2是KEAP 1的底物。氧化应激诱导Bcl-2与KEAP 1解离，导致Bcl-2：Bax异二聚体增加，从而减少细胞凋亡并提高细胞存活率。本研究测试了Bcl-2作为子宫平滑肌瘤筛选IHC染色的一部分的可适用性。结果证实了先前的发现，因为51.2%的HLRCC相关平滑肌瘤组织样本显示Bcl-2强染色（>70%的细胞显示阳性）。

本研究中用于检测FH失活的2SC抗体最近已上市，并将成为检测FH-缺陷型平滑肌瘤和HLRCC的有力工具。然而，尽管2SC抗体似乎是FH-缺陷型平滑肌瘤的特异性和敏感性标志物，但由于HLRCC综合征的罕见性，其实际使用可能仅限于专门的中心。如本文所述，可以使用常用的常规方法来识别患者进行深入的HLRCC诊断。

5 结论

与散发性子宫平滑肌瘤相比，HLRCC相关的平滑肌瘤具有根本不同的肿瘤发生途径和明显不同的表达谱。由于HLRCC患者发生侵袭性RCC的风险增加，并且年轻时出现大量子宫平滑肌瘤可能影响计划生育，因此识别这些个体非常重要。目前尚缺乏适用于人群水平常规临床实践的准确筛查方法来诊断HLRCC。目前，根据临床医生对该综合征的警觉性和认识，患者被转诊接受遗传咨询。本研究结果表明，筛查可以通过评估临床特征来加强：年轻时有症状的和大量的平滑肌瘤，以及仔细的形态学分析，尤其是免疫组化CD 34和Bcl-2联合应用。

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