摘要：子宫平滑肌瘤（Uterine leiomyoma，UL）是一种常见的良性肿瘤，有时仅根据形态学很难与子宫炎性肌纤维母细胞瘤（inflammatory myofibroblastic tumor，IMT）鉴别。IMT是一种肌纤维母细胞/纤维母细胞肿瘤，通常认为在子宫中罕见。其临床表现通常无特异性。大多数IMT具有间变性淋巴瘤激酶（ALK）的基因组重排，而迄今为止尚未在UL中检测到ALK基因异常。本文分析了2263个UL，其中9个（0.4%）有酪氨酸激酶活性。其中7份样本为ALK免疫阳性：6份样本具有ALK融合基因，1份样本过表达ALK转录物跳过外显子2-3，此外，1份样本具有RET融合基因，1份样本具有PDGFRB融合基因。虽然未发现复发性体细胞突变，但1例患者存在ALK种系突变。7例肿瘤呈平滑肌瘤样形态，1例瘤细胞轻度疏松，1例瘤细胞纤维状生长。6例肿瘤有轻至中度淋巴细胞浸润，3例未检测到淋巴细胞浸润。均未表现出侵袭性行为。除ALK强阳性（7/9例肿瘤）外，肿瘤的蛋白表达谱与UL相同，与其他间叶性子宫肿瘤不同。在基因表达水平上，这些肿瘤与已知的UL亚类没有完全分离。然而，维生素C代谢和上皮-间质转化途径在这些病变中独特地富集。

1.前言

UL是一种常见于绝经前妇女的良性平滑肌肿瘤，在白人中的发生率为70%。常见的症状包括腹痛、压迫和异常月经出血。 UL的分子特征相对较好，可分为几个亚型，它们具有不同的相互排斥的驱动因素变化，表现出不同的表达模式：MED12突变(占UL的70%)，HMGA2过表达(10%~15%)，双等位FH失活(1%)和SRCAP复合体突变(2%)。HMGA1的过度表达有时也会导致肌瘤发生，尽管它的作用不太清楚。染色体改变相对常见，包括7q的反复缺失和复杂的染色体重排。

IMT是一种比较罕见的肿瘤，偶尔也会累及泌尿生殖道。子宫IMT的常见症状也包括腹痛、压迫和异常出血；局部复发和远处转移也已被证实。对子宫间叶性肿瘤的系统性研究表明，高达0.3%的子宫间叶性肿瘤可被认为符合IMT的当前诊断标准。高达90%的子宫IMT是由影响间变性淋巴瘤激酶（ALK）的基因融合驱动的。在这些融合中，含有酪氨酸激酶结构域的ALK的3′端与高度表达基因（如TIMP 3、TNS 1或IGFBP 53）的5′端融合。除ALK外，其他酪氨酸激酶基因RET、ROS 1和NTRK 3也可能作为3′尾基因发挥作用，尽管很少。PDGFRB 3′融合在子宫外IMT中检出，在子宫IMT中未检出。到目前为止，尚未在UL中检测到影响ALK或其他酪氨酸激酶的融合基因。

IMT有3种典型的生长模式：黏液样、束状/致密和胶原化/纤维状。肿瘤也可能表现出不同生长模式的混合。典型的IMT特征包括不同程度的免疫细胞浸润、狭窄而细长的血管和不同程度的非典型性。UL与束状的IMT鉴别可能很难，因为典型的IMT特征（如炎症）可能非常少量，只存在于一小部分肿瘤中。UL和子宫IMT通常均表达肌纤维母细胞标志物（如结蛋白）。两者也都通常表现为雌激素（ER）和孕激素受体（PR）阳性。

ALK免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）已被用作子宫病变鉴别诊断的工具。大多数IMT为ALK免疫阳性，而其他子宫病变（包括UL）和正常子宫组织通常为ALK免疫阴性。与荧光原位杂交不同，IHC还可以检测染色体内重排诱导的过表达。然而，ALK IHC将错过含有影响ALK以外基因的融合的病例。RNA测序可用于鉴定ALK免疫阴性样本中的替代融合转录物。

正确诊断子宫病变和识别酪氨酸激酶融合是至关重要的，因为使用酪氨酸激酶抑制剂（如克唑替尼）治疗可能是治疗侵袭性IMT患者的有效替代方案。目前IMT的诊断是基于组织病理学结果，包括梭形细胞松散或致密的纤维束，伴有炎性浸润和ALK过表达（IHC显示）和/或ALK（或其他罕见）驱动因子抑制的证明。在本研究中，利用RNA测序来表征最初基于形态学诊断为UL的肿瘤的融合基因景观。其中9个肿瘤具有典型的与IMT相关的酪氨酸激酶融合基因，这些肿瘤在本文中被称为UL样IMT。利用组织病理学方法、拷贝数分析和RNA测序对肿瘤进行全面表征，并将受影响的分子途径与已知的UL亚型进行比较。

2.材料和方法

本研究前瞻性采集了6个不同医疗机构的子宫切除术患者的UL样本。诊断时患者年龄范围为36 - 48岁，中位数为43岁。最常见的临床症状是异常大量出血和痛经。随访期间（范围：41-91个月），无复发或转移。在9例UL样IMT中，5例为孤立性，4例至少与1个UL同时发生。UL样IMT的直径范围为2.5 - 9 cm，中位数为4.5 cm，通常位于粘膜下。其中1例患者（My 6274）在子宫切除术前接受醋酸乌利司他（Esmya）治疗3个月，据报告，这可缩小肿瘤大小。

使用福尔马林固定石蜡包埋切片（5 μm）进行IHC染色。总共22个肿瘤进行ALK染色，包括具有ALK融合（n=6）、ALK del 2 -3（n=1）、RET融合（n =1）、MED 12突变（n=5）和无融合基因的中等ALK表达（n=9）。染色强度评分为−、+、++或+++。还记录了信号的定位（核膜、核周、颗粒状染色质、弥漫性染色质）。所有ALK IHC阳性样本（n=7）以及RET融合样本均通过CD 10、ER、PR、结蛋白、钙调蛋白、平滑肌肌动蛋白、BCOR、细胞周期蛋白D1、HMB 45、C-KIT、DOG 1、CD 34、MIB 1、p53和FH的IHC染色进一步表征。MIB 1评分为每10个HPF的细胞数，其他染色评分为−、+、++或+++。从HE切片中分析ALK IHC阳性样本和具有RET和PDGFRB融合基因的样本的形态学特征。肿瘤类型被分类为黏液样、纤维样或平滑肌瘤样，细胞构成比例分为细胞减少、正常细胞或细胞过多。此外，还估计了样本的核形结构、核不典型性、核仁、核分裂计数（每10 HPF）、非典型核分裂、细胞凋亡、基质类型、坏死、炎症、血管、上皮样特征、营养不良变化和肿瘤边界类型。为了计算UL样IMT和UL之间的肿瘤大小差异，使用R软件包geepack（1.3-1）中的广义估计方程模型来评估来自同一患者的非独立肿瘤。假设了可交换的相关结构、二项随机分量和logit链接函数。

使用Illumina HiSeq对276例肿瘤和162例正常人进行RNA测序。使用HISAT 2（v2.1.0）将测序读数与GRCh37参考基因组进行比对。使用GATK（v.3.5或v.4.0）流水线进行变体调用。使用DESeq2（v1.22）进行差异表达分析和聚类。为了考虑离群值，计算所有基因的最大Cook距离，并且从差异表达分析中手动移除大于所有基因的95%分位数的基因。用SIFT 和Polyphen2评估RNA测序变体的影响。使用FusionCatcher v1.00对276个RNA测序样品进行融合（图1）。使用Inflamity Pathway Analysis进行典型途径分析，使用来自2项比较的500个最差异表达的基因（基于错误发现率）：UL样IMT（n= 8）与子宫肌层比较以及UL样IMT与子宫肌层和UL亚型（MED12、FH和HMGA2）比较。仅HMGA1过表达或未知驱动事件的UL由于其异质性而未被考虑。使用Illumina Infinium HumanCore-24或HumanOmni 2.5-8对总共2263个肿瘤及其相应的正常子宫肌层进行单核苷酸多态性阵列分析。用Illumina GenomeStudio软件提取数据，用PennCNV调整GC波（v1.2.0）。使用BAF分割调用等位基因不平衡（AI）片段（v.1.2.0），通过将所有AI片段的长度相加，计算每个样本的AI总长度（丢失、获得、杂合性丢失），其中镜像B等位基因频率≥ 0.56。

图1.A，研究的工作流程。①子宫切除术样本采集（N=2263）②SNP-阵列分析和分阶段UL突变筛查③RNA-seq样品的融合基因分析（N=276）④伴有IMT相关融合的肿瘤的组织学再评价（N=9）⑤IHC，拷贝数和表达分析

图1.B，样本My 6483 m1上的IGFBP 5-ALK融合。红色垂直线代表融合断点。C，样品My 6130 m1含有替代的框内ALK转录物ALK del 2 -3，其中外显子2和3（以蓝色突出显示）被跳过。弧处的数字表示支持外显子连接的读段的数目。覆盖率显示在y轴中。Pkinase_Tyr表示酪氨酸-激酶结构域; RPM，每百万个映射读数的读数; RPKM，每百万个映射读数的每个激酶的读数; SNP，单核苷酸多态性。

表1.UL样IMT融合基因

3. 结果

3.1融合基因的检测

研究的工作流程如图1A所示。在RNA测序的样本中，6个肿瘤具有带有ALK尾的融合转录物，并且从融合点开始显示ALK过表达（图1B）。此外，1个肿瘤过表达了跳读外显子2和3的框内ALK转录物（ALK del 2 -3）（图1C）。一个样品具有SORBS 1-RET和1个IGFBP 5 -PDGFRB融合基因（表1）。这组肿瘤（n=9）被称为UL样IMT样品。所有融合基因都经过Sanger验证。最常见的ALK断裂点位于外显子19的起始处。仅1份样本（My 6290 m3）未保留外显子19编码的ALK跨膜结构域。TNS 1和IGFBP 5在2个样品中各自是ALK的融合基因，TIMP 3和TNC在1个样品中各自是ALK的融合基因。在所有病变中，9例（0.4%）为UL样IMT。在未显示已知UL驱动基因事件（MED 12、HMGA 2、FH或SRCAP）的肿瘤中，6.6%（9/137）为UL样IMT。

3.2组织形态学特征

形态学上，与UL的最初诊断一致，UL样IMT大多数（7/9）为平滑肌瘤样。所有肿瘤均具有UL典型的肉眼外观，切面质硬旋涡状，规则边缘无出血或坏死。1例肿瘤（My 6228 m1）细胞较疏松，1例（M18 m1）呈纤维状生长（图2）。在9个肿瘤中，6个具有至少轻度的淋巴细胞炎性浸润，并且这些肿瘤中的2个具有>20个淋巴细胞/HPF。5例肿瘤为细胞或细胞过多，1例（M18 m1）为细胞过少。其中三个样本显示出轻度的核异型。然而，所有样本均显示低有丝分裂计数，无非典型核分裂、凋亡或坏死。

对所有具有ALK融合基因的样品（n = 6）和ALK del 2 -3样品（n = 1）进行ALK蛋白的IHC染色。所有这些都是阳性的，范围从部分细胞的强阳性到强的整体阳性（图3）。携带ALK del 2 -3（My 6130 m1）的样本在RNA水平上存在中度ALK过表达，但在IHC中显示强阳性。在RNA-seq中具有全长ALK转录物的中度过表达的UL是IHC阴性的（n = 9）（图3）。对所有可用的IMT（n= 8）进行ER和PR染色，所有IMT均显示这2种标志物阳性。1个肿瘤（M18 m1）无法进行IHC染色。除了My 6483 m1外，所有样品的平滑肌标志物结蛋白和钙调蛋白均为阳性，My 6483 m1对结蛋白呈强阳性，但对钙调蛋白呈阴性。还对样本进行了CD 10、BCOR、细胞周期蛋白D1、CD 34、HMB 45、C-KIT（CD 117）和DOG 1染色。结合组织形态学，这些阴性染色结果排除了包括子宫内膜间质肉瘤，血管周围上皮样肿瘤，胃肠道间质瘤和皮肤纤维肉瘤样肿瘤（COL 1A 1/PDGFB易位相关肉瘤）的诊断。所有样本均为FH非缺陷型，MIB 1评分范围为1 - 15/10个HPF，并具有野生型p53表达。

图2.IMT样本的形态学特征(HE染色)。A,My6290m3(TNS1-ALK)。B,My6428 m3(TNS1-ALK)。C,My6274m1(IGFBP5-ALK)。D,My6483m1(IGFBP5-ALK)。E,My6093m1(TIMP3-ALK)。F,My6228m1(TNC-ALK)。G,My6130m1(ALK del 2 -3)。H,My6047m6(SORBS1-RET)。I,M18m1（IGFBP5-PDGFRB）。观察到的炎症主要是淋巴细胞，范围从不显著(My 6130 m1,My 6428 m3)到强烈(My 6228 m1)。

图3.ALK IHC。A，My 6290 m3（TNS 1-ALK融合，+ALK IHC [100%细胞]）。B，My 6428 m3（TNS 1-ALK，++ ALK IHC [80%的细胞]）。C，My 6274 m1（IGFBP 5-ALK，+ALK IHC [10%细胞]）。D，My 6483 m1（IGFBP 5-ALK，+ALK IHC [30%细胞]）。E，M6093 m1（TIMP 3-ALK，+ALK IHC [100%细胞]）。F，My 6228 m1（TNC-ALK，+ALK IHC [50%细胞]）。G，My 6130 m1（ALK del 2 -3转录物，+在ALK IHC中[10%的细胞]）。H，My 6229 m4，在RNA水平上具有中度ALK表达但ALK IHC阴性的UL样本。

3.3突变与AI

UL样IMT中AI的总长度具有非常高的变异性，每个样本范围为0 bp至329 Mbp。样本具有很少的复发AI片段。3份样本在chr 2重叠ALK（2 p23）中存在广泛拷贝数变化。一个ALK融合样本（My 6290 m3）经历了染色体碎裂和2号染色体的完全粉碎（图4A）。在2个样品中检测到2号染色体的更进一步重排，包括获得和丢失：My 6428 m3和My 6228 m1（图4 B）。在5′融合基因中，TNS 1和IGFBP 5也位于2号染色体。My 6228 m1和My 6428 m3在9号染色体上有较大的染色体增益；TNC是My 6228 m1中ALK的融合基因，位于9号染色体上。My 6047 m6在20号染色体上有整条染色体增加，而My 6483 m1和My 6228 m1分别在20号染色体上有短片段的杂合性缺失和染色体增加。此外，基于RNA测序数据和Sanger验证，发现患者My 6274在外显子29中携带杂合种系ALK错义突变；Gly 1552 Trp，G>T（rs771570579）（图4C）中报告。

图4.A，主成分分析基于500个最易变的基因。B，显示PC 1至PC 3的500个最可变基因的主成分分析。C，与正常子宫肌层、MED12、HMGA2、FH和SRCAP肿瘤相比，IMT中最丰富的经典通路。D，HOXA 13（左）和JAK 3（右）在IMT、正常子宫肌层和不同UL亚型上的表达。

3.4UL样IMT中激活的通路

在主成分分析和无监督分层聚类中，UL样IMT倾向于与UL亚型分离，尽管分离不完全。特别是SRCAP UL与UL样IMT有些相似（图1A和1B）。当将UL样IMT与正常子宫肌层以及MED12、HMGA2、FH和SRCAP UL进行比较时，存在维生素C转运的显著激活和抗坏血酸盐再循环的失调。上皮间质转化（EMT）相关途径也在UL样IMT中富集（图4C）。JAK-STAT信号传导，一种可以激活EMT的途径，也在UL样IMT中富集，并且在基因水平上JAK 3过表达（图4D）。在UL样IMT与子宫肌层的比较中，多种细胞外基质（ECM）相关途径富集。当分析在子宫肌瘤发生中重要的基因时，在大多数UL中显著上调的HOXA 13 32在所有研究的UL样IMT中下调（图4D）。HMGA 2在UL的HMGA 2亚型中独特地过表达，显示轻微的也在UL样IMT和HMGA 1中的过表达，其上调也可被归类为UL驱动事件，在多种UL样IMT中显示高表达。在所有肌瘤亚型中上调的SATB 2在UL样IMT中表现出异质性表达模式。

4. 讨论

在这项研究中，分析了一组2263例最初诊断为UL病例的形态学特征。总的来说，这些病变中有9例（0.4%）携带IMT相关酪氨酸激酶融合基因，被称为UL样IMT。基于ALK IHC和IMT提示形态学特征，0.3%的子宫肌瘤被重新分类为IMT。所有解剖部位的IMT复发率约为25%。预测子宫IMT行为的组织病理学标准描述不完全。直径（>7cm）、显著的核分裂、淋巴管浸润、高核分裂计数（>10/10HPF）和肿瘤坏死与不良结局相关。本系列中的一个肿瘤较大（9cm），但未观察到其他不良预后因素。IMT复发的风险与肿瘤切除的完整性有关。子宫IMT通常行全子宫切除术切除。平滑肌瘤样IMT的明显良性行为可能会引起人们对正确诊断该实体的重要性的质疑。由于迄今为止描述的平滑肌瘤样IMT数量相对较少，并且随访时间有限，因此不可能进行真实的风险评估。值得注意的是，1例患者接受了选择性PR调节剂醋酸乌利司他（一种可用于治疗UL的药物）治疗，患者为孤立性肿瘤并在治疗期间缩小。

具有全长ALK转录物中度过表达的UL未显示ALK免疫阳性。然而，本研究分析中的一种肿瘤表达了一种跳读外显子2和3的框内ALK变体转录本，并且在一个细胞亚组中具有强ALK IHC阳性。这种转录变体以前曾在神经母细胞瘤中报道过，这是另一种肿瘤类型，其中ALK过表达与肿瘤发生有关。Antonescu等人检测到6例ALK融合阴性IMT伴阳性IHC，并提出了ALK激活的可能替代机制。尽管还需要进一步的研究，但观察到的ALK del 2 -3转录本可以解释此类病例子集中的ALK激活。

与子宫IMT的典型情况一样，除1例（My6290m3）ALK融合病例外，其余36例均保留ALK跨膜结构域。其中一个样本（My6093m1）显示出罕见的连接TIMP 3的外显子1与ALK的外显子12的融合。通常，ALK断裂点位于外显子19，不常见断裂点的可能作用仍有待研究。所有样本均具有相似的颗粒状细胞质ALK染色模式。ALK的融合基因在样本集中变化，包括新的融合基因腱生蛋白-C（TNC）。TNC编码ECM蛋白，并且其在平滑肌组织中高度表达。TNC以前与转移和组织重塑有关，并且据报道它是非小细胞肺癌中NRG 1的融合基因。本文报道的其他ALK融合基因以前曾在IMT中报道过。除ALK外，本文数据集中的2种肿瘤还存在其他酪氨酸激酶融合。SORBS 1-RET融合基因在肺癌中有特征性表达，但在IMT中没有。PDGFRB融合基因先前已经被在腹膜和肺的IMT中有报道，但在子宫IMT中没有报道。有趣的是，IGFBP5（此处为PDGFRB和ALK的融合基因）被认为在UL中发挥作用，其中编码切割IGFBP5的蛋白质的基因过表达。总之，这项研究突出了子宫ITM融合基因景观的异质性。

在UL中，染色体断裂很少发生，而更细微的染色体改变相对常见，特别是在MED12野生型病变中。在IMT中，在少数转移性肿瘤中检测到复杂的染色体重排，包括染色体断裂。在本研究中，1例ALK IHC强阳性的肿瘤（My6290m3）显示携带ALK的2号染色体的明显染色体断裂。然而，肿瘤没有表现出攻击性行为，具有正常的细胞结构，低有丝分裂计数，边界清楚，p53免疫组化染色正常。未检测到UL典型的染色体改变，如7q缺失。

在当前研究中，1例患者发生ALK种系突变。这提出了一个有趣的可能性，即IMT的生殖系易感性。有趣的是，突变携带者的母亲被诊断出患有低级别子宫内膜癌。种系ALK突变与家族性神经母细胞瘤和髓母细胞瘤有关。这些突变影响蛋白质的酪氨酸激酶结构域。在本研究数据集中，ALK种系突变位于基因的C末端，其可能的意义需要进一步研究。

通过同时比较UL样IMT与UL和正常子宫肌层，我们观察到UL样IMT中激活的EMT和JAK-STAT通路。先前已经表明，EMT也在EML 4-ALK融合的肺癌中被激活。类似地，JAKSTAT通路与ALK过表达的肺癌有关。因此，ALK过表达在这些不同的肿瘤类型中引起类似的下游效应。维生素C代谢相关途径也在UL样IMT中被激活，并且这些途径中的许多基因（如GJB 2）与癌症有关。维生素C代谢也已显示在MED 12 UL中在基因表达和代谢组学水平上发生改变，并具有维生素C抗氧化作用激活的预测效应。在聚类中，UL样IMT样本显示与SRCAP突变的肿瘤最相似，可能是因为在SRCAP UL中观察到中度ALK过表达。当比较UL样IMT与正常子宫肌层时，ECM相关通路出现。UL的特征在于ECM的异常沉积和许多相关途径的失调，表明ECM是所有研究的肿瘤类别中的关键因素。

与UL的最初诊断相一致，大多数（7/9）酪氨酸激酶融合阳性肿瘤的形态学特征为平滑肌瘤样，呈束状生长模式。此外，3例肿瘤没有炎症，使得基于形态学特征的IMT诊断是不可能的。虽然在这里收集的样本和最初诊断为IMT的样本之间的确切数字很难比较，但似乎在子宫中，经典IMT可能不如UL样IMT常见。平滑肌标志物desmin和caldesmon在所有肿瘤中均呈强阳性，但My 6483 m1的caldesmon染色为阴性。如前所述，本研究的UL样IMT样本也为ER和PR阳性。这些标志物通常在苗勒管衍生肿瘤中呈阳性，但在子宫外IMT中不呈阳性。这表明子宫和子宫外IMT的细胞来源可能不同。

本研究中的肿瘤均由妇科病理学经验丰富的病理学家检查，所有肿瘤均主要归类为普通型或富于细胞性平滑肌瘤。它们被鉴定为UL样IMT只是因为肿瘤进行了分子分析，尽管其中大多数（7/9）仅通过ALK IHC发现。然而，在常规诊断中，对所有UL进行ALK IHC是不切实际的。具有粘液样特征和/或显著炎症浸润的病例应接受ALK IHC。它也可能是有益的一部分，用于诊断子宫间叶肿瘤与不寻常的形态学特征的一组标记物。目前关于这些酪氨酸激酶阳性UL样肿瘤的临床行为的信息不足，需要对随访时间较长的大型材料进行研究。

本文描述的酪氨酸激酶融合阳性肿瘤与普通UL的形态学和免疫特征（大多数情况下ALK除外）之间的相似性，提出了正确分类这些肿瘤（IMT或UL）的问题。最新的WHO肿瘤分类：女性生殖器肿瘤（第五版，2020）对IMT的定义如下：“原发性：具有粘液样和束状生长的温和梭形细胞;淋巴浆细胞性炎症; ALK IHC表达（罕见例外）。理想：ALK重排。”该定义强调了形态学的重要性，ALK重排是次要标准，这是合理的，因为ALK重排并非见于所有IMT，ALK重排可见于多种其他肿瘤类型。在数据分析中，基于最可变的基因的表达水平，没有看到UL和UL样IMT的完美分离。相反，子宫肌瘤发生的重要基因，如HOXA 13，在UL和UL样IMT之间差异表达。需要比较UL和IMT的分子特征与侵袭性临床病程和/或明确的IMT形态，以正确分类UL样IMT。

点此下载原文献