1.前言

EB病毒（EBV）相关性平滑肌肿瘤（EBV-SMT）是一种罕见的平滑肌源性间叶性肿瘤，可发生于3种临床表现为免疫缺陷的疾病，包括艾滋病毒/艾滋病、移植后相关的免疫抑制和先天性免疫缺陷。这些肿瘤发生在<1%的移植患者中，并且最常影响肝脏，特别是肝移植受体中的供体肝脏和其他实体器官移植受体中的自体肝脏。尽管大多数移植后EBV-SMT（PT-EBV-SMT）是在移植后2年或更长时间发生的晚期事件，移植后12个月内发生的早发性肿瘤往往在年轻患者中更常见。缺乏细胞浸润，不寻常的受累部位和EBV感染的存在将PT-EBV-SMT与平滑肌肉瘤（LMS）区分开来。EBV-SMT在AIDS患者中具有不同的临床结局。HIV/AIDS患者中的EBV-SMT在3种主要的EBV亚型中表现出最差的总生存率。此外，在常见变异性免疫缺陷、共济失调毛细血管扩张症和ATM、ADA、IL 2 RG、ZAP 70、GATA 2和CARMIL 2突变引起的原发性免疫缺陷患者中发现了EBV-SMTs。在这些原发性免疫缺陷疾病中，T细胞和/或自然杀伤细胞免疫力受损会促进EBV-SMT发病机制。

许多先前的研究表明，EBV-SMT通常以多灶性方式出现在同一患者的不同解剖部位或时期。先前基于病毒的克隆性研究表明，它们可能代表独立的再感染事件，并且通常缺乏积极的临床进展。EBV-SMT均表现出形态学和免疫组织化学平滑肌特征，它们还具有原始圆形细胞和瘤内淋巴细胞浸润的独特组织学特征。关于临床行为，患者的免疫状态而不是组织学特征在确定临床结局方面似乎更重要。

尽管目前基因组技术取得了进展，但缺乏基因组关于EBV-SMT的分析，这可能是由于这些肿瘤的罕见性。先前的一项研究报告，亚洲移植后患者队列中EBV-SMT的发病率高于北美队列，这表明地理、种族和遗传因素可能影响这些肿瘤的发病率。

LMS的特征在于广泛的基因组不稳定性，例如在某些情况下发生染色体断裂和全基因组重复。重复DNA拷贝数变异（CNA）通常影响肿瘤抑制基因，例如PTEN，RB 1和TP 53，但存在适度的体细胞突变负担，表明肿瘤发生主要由CNA驱动，而不是单核苷酸变异。这与平滑肌瘤（LM）中没有这种重复CNA形成对比。本研究旨在描述EBV-SMT中CNA的特征，并将此信息与临床病理特征相关联。在这项研究中，重点专注于子宫外SMT与EBV-SMT的比较，因为后者只发生在子宫外的位置。此外，子宫外SMT的研究比子宫内SMT少得多。

2.临床病理发现

从新加坡的2家主要三级医院（国立大学医院和新加坡综合医院）收集了12年（2009-2021年）的EBV-SMT、子宫外LM和LMS患者的组织样本（石蜡块、未染色石蜡切片）。该研究包括11例EBV-SMT患者，其中6例为HIV阳性（H-EBV-SMT），5例为PT-EBV-SMT。在PT-EBV-SMTs患者中，4例患者接受了肾移植，1例患者接受了肝移植。子宫外软组织LMs（6个样本）和LMS（7个样本）也进行了分析，与EBV-SMT病例进行结果比较。在EBV-SMT队列中，4例患者为男性，7例患者为女性，年龄范围为2-68岁。在11例患者中，8例表现出多灶性EBV-SMT，导致11例患者的22个肿瘤。

在22例EBV-SMT中，4例发生在呼吸道（18.18%），4例肿瘤（来自1例患者）发生在四肢（18.18%），5例为颅内（22.73%），涉及脑、海绵窦、蝶骨嵴和额硬脑膜。肿瘤位于淋巴结（3个肿瘤; 13.4%）、肝脏（2个肿瘤; 9.09%）、口咽部（2个肿瘤; 9.09%）、眼眶（1个肿瘤; 4.55%）和脊髓（1个肿瘤; 4.55%）。大多数患者（8/ 11，72.7%）表现为多灶性肿瘤。PT-EBV-SMT的多灶性发生率略高于H-EBV-SMT（分别为80%和66.7%）。

大多数EBV-SMT至少包含局灶性原始形态，所有与移植相关的病例均显示原始形态。核分裂率大多较低（每10 HPF <1-5个核分裂象），淋巴细胞密度一般较低。在1例颈部淋巴结H-EBV-SMT成人患者中观察到高有丝分裂活性（>20个有丝分裂像/10 HPF）。在PT-EBV-SMT病例中观察到密集的淋巴细胞浸润。本研究中的EBV-SMT均未显示肿瘤坏死。

在这项研究中，没有EBV-SMT患者死于这些肿瘤。两名H-EBV-SMT患者因晚期艾滋病而死于艾滋病相关疾病。1例接受抗逆转录病毒治疗的H-EBV-SMT患者（病例6）在最近一次随访（2年无疾病）前无新发病变。至于PT-EBV-SMT，3名患者在肿瘤初次出现后开始接受雷帕霉素（mTOR）哺乳动物靶点抑制剂西罗莫司治疗。其中一名患者是新生儿，在2岁时接受了肝移植和表现为多个原始形态的EBV-SMT。该患者来自海外，随后失访。另外2例患者分别在7年和6年后在不同部位出现新病变。

3.EB病毒相关性平滑肌肿瘤、平滑肌瘤和平滑肌肉瘤的拷贝数变异

用染色体分析套件鉴定至少3个肿瘤中具有重复CNAs的基因。在EBV-SMT（ES）中，重复拷贝数增加或缺失的基因数分别为13，410和6604，LM中为4881和412，LMS中为6042和17，259。LMS中的拷贝数缺失大于EBV-SMT中的拷贝数缺失。样品的无监督分层聚类显示，EBV-SMT中的CNA与LM比与LMS更相似。

广泛、局灶性和整体CNA评分分布的成对比较显示，EBV-SMT和LMS中的整体CNA和局灶性CNA显著不同（P<0.05）。除7号和14号染色体外，所有体细胞染色体都含有EBV-SMT和LMS之间显著不同的区域。在EBV-SMT中，7个基因集富集在具有拷贝数增加的基因中（干扰素γ应答、IL 2-STAG 5信号传导、DNA修复、干扰素α应答、同种异体移植排斥、G2 M检查点和上皮-间质转化），而4个基因集富集在具有拷贝数缺失的基因中（未折叠蛋白应答、凝血、DNA修复和Myc靶标-v1）。在LM中，只有1个基因集（炎症反应）在拷贝数增加的基因中显著富集。没有基因集合富集LMs中具有拷贝数缺失的基因。在LMS中，2个基因集富集了拷贝数增加的基因（早期雌激素反应和p53途径），而4个基因集富集了拷贝数缺失的基因（干扰素α反应、干扰素γ反应、UV反应和炎症反应）。

在EBV-SMT、LM和LMS中鉴定了具有重复拷贝数增加和缺失的癌基因。在EBV-SMT中具有重复拷贝数增加的癌基因包括MYC、RUNX 1、CCND 2和ETS 2。在EBV-SMT中具有重复拷贝数增加的基因显示组蛋白脱乙酰酶（HDAC）和HDAC相关基因的显著富集。

来自Infinium MEPIC阵列的EBV-SMT的拷贝数变异概况显示在所有4种EBV-SMT中具有显著拷贝数缺失的基因包括LMF 1、AXIN 1、NME 4、METRN、JM JD 8、CHTF 18、LUC 7 L、STUB 1、RPUSD 1、MSLN、FAM 234 A、HAGHL、CAPN 15和METTL26（P<0.05）。

与病毒感染相关的基因在EBV-SMTs中观察到的CNA中富集。T1中拷贝数显著增加的基因（患有PT-EBV-SMT的患者7）在基因本体生物学过程中富集（调整后P<0.05）。此外，在T3中观察到TLR 7和TLR 8的拷贝数增加，TLR 7和TLR 8参与对病毒的防御反应和白细胞介素-8生物合成过程的调节。

在EBV-SMTs中鉴定出具有CNAs的癌症相关基因。与胃癌相关的DCDC 2、MRS 2、KAAG 1和RREB 1的拷贝数丢失（校正P<0.05）在T1（PT-EBV-SMT的患者7）中发现。RBMS 3的拷贝数增加与骨和结缔组织的癌症相关（校正P<0.05），在T2中发现（患有H-EBV-SMT的患者6）。在T3（H-EBV-SMT的患者1）中发现DNA错配修复基因MSH 2和MSH 6的拷贝数丢失。

MEPIC阵列可以使用肉瘤分类器进行肿瘤分类。在肉瘤分类器的基础上，T1（7例P-TEBV-SMT患者）被分类为LMS。其他三种EBV-SMT（T2、T3和T4）未被归类为LMS或任何其他肉瘤。MEPIC和OncoScan均检测到EBV-SMT中与宿主对病毒感染的免疫应答和肿瘤发生相关的基因拷贝数增加。

4.讨论

由于许多因素，EBV-SMT先前被指定为恶性肿瘤，在骨和软组织肿瘤的最新WHO分类（2020）中，SMT被分类为良性肿瘤如LM，中间肿瘤如EBV-SMT和恶性潜能不确定的SMT以及恶性肿瘤包括LMS（未另行说明）和炎性LMS。目前将EBV-SMT指定为中间肿瘤部分是由于缺乏该实体的可用基因组证据，而不是其他SMT（如LM和LMS）的大量基因组数据。因此，EB病毒基因组研究EBV-SMT不仅需要确定这些肿瘤是否具有特定的分子标志，而且还需要分析它们是否与其他肿瘤不同。

拷贝数分析表明，EBV-SMT和LMS可以在分子水平上区分。EBV-SMT和LMS之间的全球CNA负荷存在显著差异有助于区分EBV-SMT和LMS。总体CNAs和局灶性CNA在LMS中最高，在LM中最低。EBV-SMT和LM之间的局灶性拷贝数评分存在显著差异，但染色体水平的变化无显著差异。染色体和臂水平的稳定性是最高的在LM和最低的在LMS。这些发现与这些肿瘤的一般临床表现一致。LM是良性的和非侵袭性的，而LMS是恶性的，具有转移的能力。与LMS相比，在EBV-SMT中观察到的较低CNA负荷与其作为中间肿瘤的分类一致。由于病例数太少，无法对单灶性与多灶性肿瘤和有丝分裂活性相关的CNA得出明确的结论，尽管没有观察到明显的差异。文献报道组织病理学特征（如细胞凋亡和有丝分裂活性）与临床行为之间无相关性。对较大队列进行深入生存分析将进一步阐明CNA与这些肿瘤临床结局之间的关联。

在EBV-SMT中具有重复拷贝数增加的基因中鉴定出潜在的癌基因。与先前的研究一致，研究发现，在>50%的EBV-SMT病例中检测到MYC拷贝数增加。增加的MYC表达与EBV-SMT的不受控制的增殖有关。除了MYC，在EBV-SMT中鉴定的具有重复拷贝数增加的基因包括RUNX 1、CCND 2和ETS 2。参与上皮-间充质转化的基因（如COL 4A 1、COL 6A 3、LAMC 2、Vim、PTHLH、LRP 1、IL 15、WNT 5A、TIMP 3、NOTCH 2和VEGFC）的重复拷贝数增加可能导致侵袭性和耐药性。此外，与DNA修复相关的基因的重复拷贝数缺失可能导致EBV-SMT的基因组不稳定性。

还使用MEPIC阵列平台鉴定了EBV-SMT中的CNA。在4种EBV-SMT（T1、T2、T3和T4）中具有显著拷贝数缺失的基因包括LMF 1、AXIN 1、NME 4、METRN、JMJD 8、CHTF 18、LUC 7 L和STUB 1。这些基因以前曾被报道在丙型肝炎病毒感染后下调（GSE 20948，GSE 29889）。AXIN 1缺失可能通过细胞生长调节机制的缺失而驱动肿瘤发生。CHTF 18缺失可能在有丝分裂中引入错误，导致染色体不稳定，染色体不稳定性可导致染色体化学计量不平衡、基因表达水平改变、细胞表型显著改变其他可能驱动肿瘤发生的患者特异性CNA包括T3中DNA错配修复基因MSH 2和MSH 6的拷贝数缺失和T4中DNA错配修复基因MSH 2和MSH 6的拷贝数缺失在T1中ZFHX 3的增益。DNA错配修复基因的拷贝数缺失可导致促进肿瘤发生的驱动突变的积累。ZFHX 3是一种调节肌源性和神经元分化的转录因子，其作为某些癌基因的转录激活因子的作用可能有利于细胞周期进展和肿瘤细胞的生长。功能研究可能为这些基因在EBV-SMT肿瘤发生中的作用提供进一步的机制见解，具有潜在的治疗意义。进一步的研究旨在验证这些改变的临床意义，也可能发现可用于危险分层的预后生物标志物。

在EBV相关的伯基特淋巴瘤、鼻咽癌和胃癌中已经报道了CpG岛超甲基化。由于EBV-SMT的罕见性，其表观遗传失调仅在1项8例EBV-SMT关于肿瘤抑制基因RASSF 1A甲基化的研究中报道。在这项研究中，在至少3种EBV-SMT中发现HDAC的重复拷贝数增加，表明在EBV-SMT肿瘤发生中的表观遗传学改变中起重要作用。因此，丙戊酸（一种HDAC抑制剂）已被证明可有效杀死EBV感染的T细胞和自然杀伤淋巴瘤细胞。值得注意的是，西达米特（一种HDAC抑制剂）已被用于治疗复发性和转移性EBV相关实体瘤（NCT 03494634）。这项研究的结果揭示了使用HDAC抑制剂作为难以切除的EBV-SMT的靶向治疗选择的可能性。

MEPIC阵列检测显著CNA和不同表观遗传谱的能力增强了其临床实用性。EBV-SMT（T1）在较长时间内累积的表观遗传修饰是否会驱动EBV-SMT中的肿瘤发生仍有待确定。其他三种EBV-SMT（T2、T3和T4）显示出与肉瘤分类器中的实体不匹配的甲基化谱，这意味着一些EBV-SMT具有与任何肉瘤不共享的独特甲基化模式。

肿瘤微环境与EBV相关鼻咽癌的发病机制有关，并且在EBV相关胃癌中发现干扰素γ途径中的基因上调。研究显示，EBV-SMT中与病毒感染反应相关的基因和LM中与炎症反应相关的基因的拷贝数增加，以及与LMS炎症反应相关的基因的拷贝数丢失。据推测，极高的病毒载量有助于EBV-SMT的发病机制。EBV-SMT中病毒应答基因的重复拷贝数增加支持了这一假设。在EBV-SMT中，宿主中病毒诱导的炎症反应可能引发感染细胞转化和肿瘤生长。尽管宿主免疫反应的激活可能减缓了EBV-SMT中的肿瘤发生，但炎症和上皮-间质转化与癌症进展有关。总之，CNA表明肿瘤免疫微环境影响EBV-SMT中的肿瘤生长。值得注意的是，nivolumab是一种程序性死亡-1（PD-1）抑制剂，已在EBV相关淋巴瘤或淋巴增生性疾病患者中与EBV特异性细胞毒性T淋巴细胞联合使用（NCT 02973113）。在增强的宿主免疫反应方面EBV-SMT可能导致对激活免疫疗法的有利反应，其目的是放大免疫反应。

5.结语

EBV-SMT的CNA负荷低于子宫外LMS。虽然与LMs相比，EBV-SMT与LMS更紧密一些，但EBV-SMT显示出与LM和LMS的显著基因组差异。表观遗传学改变可能在肿瘤发生中起重要作用，因为在HDAC中发现了重复拷贝数增加。肿瘤微环境中宿主免疫反应的增加可能有助于EBV-SMT肿瘤发生。由于此类病例罕见，日后更大规模的研究具有更广泛的临床预后和组织学特征，以及对这些癌症的基因表达、突变、甲基化和CNA谱的综合分析，可能会进一步阐明特定基因和途径在肿瘤发生中的作用。从而，更深入地了解EBV-SMT肿瘤发生的分子机制和发现用于精准医学的新药铺平道路。