摘要 EBV通过各种分子机制刺激鼻咽上皮细胞的肿瘤转化，主要影响肿瘤抑制基因的失活和癌基因的激活。EBV感染是鼻咽癌的主要危险因素，但其在鼻咽癌发生中的作用尚不清楚。EBV感染改变抗凋亡蛋白和肿瘤抑制蛋白的表达。因此，本研究调查对比了喉癌和鼻咽癌病例中EBV感染状态与Bcl-2和TP 53蛋白表达之间的相关性。这项研究是在22例鼻咽癌和11例喉癌病例中进行的。采用免疫组化方法检测EBV感染、TP 53和Bcl-2蛋白表达情况。大多数喉癌病例预后差，Bcl-2表达低。鼻咽癌（NPC）中EBV感染率为22.7%，TP 53表达与EBV感染相关，EBV感染与TP 53表达上调相关，提示TP 53和EBV之间存在相互调节。

1.前言

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）包括一组在上呼吸消化道粘膜层发展的癌症。HNSCC在性质上存在异质。鼻咽癌（NPC）和喉癌是HNSCC中最常见的癌症，其次为唇癌和口腔癌。根据全球癌症统计数据，据报道，2018年全球诊断出177422例新发喉癌和129079例新发NPC病例，在常见的癌症中分别排名第23位和第25位，发病率为所有癌症的1.7%。

1964年，EBV是在伯基特淋巴瘤肿瘤细胞中发现的第一种人类肿瘤病毒。后来的研究在伯基特淋巴瘤患者和鼻后间隙癌中发现了抗体。De Schryver等证明了通过免疫荧光试验检测EBV抗原，随后zur Hausen等在NPC中使用了杂交方法。EBV感染在个体中非常常见，并且感染全球>90%的人群。通常，EBV感染是无症状的；然而，在几种上皮和淋巴恶性肿瘤中确定了EBV参与癌症发病机制。

1990年至2010年间，EBV相关恶性肿瘤的全球占比增加了14.6%，在此期间，东亚占EBV感染癌症病例的近50%。EBV相关癌症的发病率约占全球所有癌症的1.5%，占所有癌症相关死亡的1.8%。在EBV相关的癌症死亡中，92%归因于NPC和胃癌。EBV可能通过改变表观遗传学特征、诱导基因组不稳定性、逃避宿主免疫、促进细胞存活或促进NPC细胞的干细胞样特性以及凋亡和肿瘤抑制基因的体细胞突变参与NPC的发病机制。

肿瘤抑制因子p53和抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）被假设在癌发生中起关键作用，并且在其他类型的HNSCC中观察到这些蛋白的上调表达。TP 53是一种关键的肿瘤抑制因子，通过调节抗增殖转录程序，包括瞬时细胞周期停滞，细胞衰老和凋亡，对各种应激信号做出反应。尽管有各种各样的TP 53网络调节剂和各种TP 53调节的生物学途径，但人们对TP 53如何以及在何种背景下发挥其不同的作用缺乏明确的理解。

在EBV相关肿瘤中，野生型TP53的表达上调，这被证明与潜伏的EBV膜蛋白1(LMP1)有关。TP53和LMP1之间的相互调节可能在EBV感染和潜伏期中起重要作用。类似地，抗凋亡蛋白Bcl-2是癌症细胞程序性死亡或凋亡的关键抑制因子。在鼻咽癌的发病机制中，Bcl-2的表达上调通过调节细胞凋亡发挥重要作用。本研究评估了在沙特鼻咽癌和喉癌队列中与EBV感染相关的TP53和Bcl-2的蛋白表达模式，以确定这两种蛋白与EBV感染的相关性和相互作用。

2.材料与方法

2.1研究队列 从沙特阿拉伯达曼的伊玛目Abdulrahman Bin Faisal大学（IAU）的King Fahd医院病理科收集来自确诊的鼻咽癌（n=22）和喉癌（n=11）患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样品。患者的中位年龄为51岁（年龄范围为18-90岁），队列中有22名男性和11名女性。该研究已获得IAU机构审查委员会的批准（批准号IRB-2017-01-059）。从纳入研究的每例患者处获得签署的知情同意书。本研究中的程序遵循赫尔辛基宣言的原则。所有标本均为活检标本。根据2014年沙特阿拉伯的癌症发病率报告，使用流行病学计算程序开源项目的“样本量分析”模块（openepi.com/SampleSize/SSPropor.htm）。这些组织样本是从2000年5月至2015年2月期间在法赫德国王医院肿瘤诊所就诊的患者中收集的。样本采集的入选标准基于通过组织病理学分析确认的喉癌和/或鼻咽癌。排除肿瘤组织含量<50%的FFPE样品。本研究仅包括从患者获得的肿瘤组织。

2.2免疫组织化学 用苏木素和伊红染色检测FFPE块的肿瘤含量和诊断情况。组织切片在室温下制备，苏木精-伊红染色总时间为45min。用免疫组织化学方法检测4-µM FFPE切片中TP53和Bcl-2蛋白的表达及EBV感染情况。抗TP53的一抗检测到了TP53蛋白的野生型和突变型。抗Bc l-2抗体与人Bcl-2蛋白的N末端区域结合。EB病毒一抗与EB病毒潜伏膜蛋白(LMP-1)结合。所有上述抗体都是在没有稀释的情况下使用的，因为它们是以现成的形式获得的。所有三种抗体的孵育温度均为37˚C，TP 53、Bcl-2和EBV的孵育时间分别为16min、20min和26 min。Ultra-View通用DAB检测试剂盒用于与具有过氧化氢底物和3，3 '-二氨基联苯胺四盐酸盐色原的靶抗原结合将一抗可视化，其产生棕色沉淀（图1）。使用Benchmark超声染色仪器(Roche Diagnostics)进行染色，结果由两名独立的病理学家使用光学显微镜(放大倍率，x40；徕卡微系统公司)进行定性判读。如果肿瘤细胞显示核染色，则认为肿瘤细胞为TP53阳性；如果肿瘤细胞显示胞浆和/或膜染色，则确认为Bcl-2阳性。每种染色程序均采用阳性和阴性组织对照(图2)。Bcl-2和TP53免疫组织化学的对照样本分别来自扁桃体和结肠癌。患者均为男性，年龄51岁(扁桃体癌)和48岁(结肠癌)。这些样本是从在获得同意后前往大学法赫德国王医院肿瘤科诊所就诊的患者身上收集的。一种EBV阳性对照玻片从商业上获得。

图1.Bcl-2、EBV和TP 53的代表性免疫组织化学染色图谱图像.（A）Bcl-2阳性鼻咽癌样本;（B）EBV阳性鼻咽癌样本;和（C）TP 53阳性喉癌样本的代表性图像.放大倍数，40倍。

图2.Bcl-2、EBV和TP 53的代表性阳性和阴性免疫组织化学染色图谱图像.(A)Bcl-2阴性对照;（B）TP 53阴性对照;（C）EBV阴性对照;（D）Bcl-2阳性对照;（E）TP 53阳性对照;和（F）EBV阳性对照。

2.3统计学分析 使用SPSS 20版（IBM Corp.）分析临床和组织病理学数据研究的蛋白表达（定性）结果。使用Fisher精确检验（表I）分析类别变量间的比例分布，对于连续变量，使用非配对Student t检验（表I）。使用Spearman's Rank秩相关检验确定变量之间的双变量关系（表II和III）。P<0.05为统计学显著性差异。

表1.鼻咽癌和喉癌组患者的临床、病理和蛋白表达参数

表2.总队列（鼻咽癌和喉癌组）中EBV、Bcl-2或TP 53表达与临床和组织病理学参数之间的相关性

表3.鼻咽癌队列中EBV、Bcl-2或TP 53表达与临床和组织病理学参数的相关性

3 结果

性别分布分析显示，鼻咽癌和喉癌分别有59%和81%的患者为男性。鼻咽癌患者的中位年龄为49.5岁，而喉癌患者的中位年龄为65岁。鼻咽癌未分化肿瘤占68.2%，低分化肿瘤占22.7%，中分化肿瘤占9.1%。喉癌高分化组27.3%，中分化组63.6%，低分化组9.1%。鼻咽癌以3级为主(86.4%)，喉癌以1级和2级为主(91%)(P=0.0004)。同样，54.5%的鼻咽癌患者处于疾病的晚期，而在喉癌组中，仅有27.3%的患者处于晚期。在吸烟方面，喉癌患者组(72.7%)高于鼻咽癌患者(36.4%)。

根据患者5年随访情况计算预后，复发或死于疾病被认为是预后不佳的结果。91%的喉癌患者预后不良，而鼻咽癌患者预后不良的比例为50.00%(P=0.027)。喉癌患者中完全没有EBV感染，而鼻咽癌组EBV感染率为22.7%。Bcl-2在鼻咽癌中的表达率高于喉癌（P=0.027）。TP 53表达在两个患者组之间没有产生任何显著差异（表I）。临床、组织病理学和蛋白表达变量之间的双变量相关性也证实了喉癌患者的预后不良（P=0.002）和NPC病例的晚期肿瘤分级（P≤0.005；表II）。这些结果表明，在NPC组群中EBV感染与TP 53表达相关（P=0.009；表III）。

4 结论 

鼻咽癌组织中EB病毒感染与TP 53和Bcl-2表达上调相关，提示TP 53和Bcl-2与EB病毒相互调节。

5 讨论

  EBV目前是一种公认的致癌物，也是几种癌症的致病因素，包括上皮和淋巴起源的癌症、胃癌、NPC以及霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。1990-2010年间，EBV相关癌症增加了14.6%，其中50%的病例发生在东亚患者中。在全球所有癌症病例中，约1.5%的癌症病例与EBV感染相关。

NPC主要与EBV相关，并且NPC中的EBV感染频率基于种族和地理差异而变化。流行区的NPC病例几乎全部为EBV感染，非流行区的NPC均为EBV阴性。EB病毒相关的NPC患病率在东南亚最高；在沙特人群中，关于NPC中EB病毒频率的数据很少。本研究发现22.7%的鼻咽癌患者存在EB病毒感染。类似地，在伊朗队列中发现NPC中EBV的频率为28%，巴西研究中为44%，阿曼研究中为53.84%。本研究中EBV感染相关NPC的百分比相对较低，可能是由于研究区域为EBV非流行区。

由于肿瘤的异质性以及不同的临床和组织病理学状况，识别单一生物标志物以计算癌症的风险和预后是困难的。然而，单个生物标志物与其他生物标志物在细胞信号传导、凋亡和细胞分化等途径中的相互作用可能揭示肿瘤发生的机制。因此，在所有病例中评估Bcl-2和TP 53蛋白表达，以确定EBV感染之间的相关性。Bcl-2家族蛋白质是凋亡途径中的关键调节因子。在Bcl-2家族蛋白中，有促凋亡和抗凋亡调节剂；Bcl-2蛋白是抗凋亡成员。与其他类型的HNSCC相比，在NPC病例中观察到Bcl-2蛋白上调更频繁，在本研究中观察到类似的模式；与NPC患者相比，喉癌患者中Bcl-2表达上调的频率较低。在74.3%的NPC病例中观察到Bcl-2上调，类似地，本研究显示在50%的NPC肿瘤中观察到Bcl-2上调。Bcl-2表达上调可能通过抑制鼻咽癌细胞凋亡而促进肿瘤细胞存活。因此，尽管确切的分子机制尚不清楚，但Bcl-2的上调可能突出了NPC发病机制中的重要机制。

TP 53通过不同的机制在细胞周期停滞和凋亡中起着至关重要的作用。TP 53在鼻咽癌中的阳性表达率在不同的研究中不同，报道的值分别为34.7%、65.6%和52.2%。本研究的结果与这些先前的研究一致，其中50%的NPC肿瘤表现出TP 53上调。目前的数据显示，TP 53上调与鼻咽癌中的EBV感染有关。类似地，几项研究报告野生型TP 53在EBV相关癌症中上调。细胞凋亡由TP 53上调诱导，然而，EBV转化细胞对TP 53介导的细胞凋亡敏感，这表明EBV阳性和EBV阴性肿瘤是不同的组。本研究以EB病毒60 kDa LMP-1为靶点，通过免疫组化方法检测EB病毒感染，结果提示TP 53与LMP-1之间的相互调节可能在EB病毒相关的NPC中起重要作用。但需要进行额外的机制研究以确定TP 53介导的LMP 1刺激。本研究的主要缺陷是缺乏免疫组织化学实验的定量数据。

HNSCC表现出对标准治疗方式的不同反应的可变预后，这可能是由于显著的病因学和分子异质性。目前的数据表明，喉癌的预后比鼻咽癌差。大多数鼻咽癌患者的肿瘤分级较高，预后良好。据报道，辅助化疗和放疗联合治疗可改善预后和生存率。据我们所知，这是第一个初步研究揭示了EB病毒相关的鼻咽癌在少数民族人群中使用免疫组化方法检测。本研究还试图通过确定EBV感染与主要肿瘤抑制因子TP 53之间的相关性，揭示EBV相关NPC发病机制的细胞机制。另外需要进行额外的机制研究以确定NPC中TP 53介导的EBV LMP1刺激。并且对EBV致癌过程的进一步了解可能有助于开发NPC的新疗法。

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