引言：多个临床试验成功证实抗体-药物缀合物（ADC）对HER2低表达癌具有显著的治疗反应。相应的乳腺癌HER2检测和判读指南呼之欲出，让我们先了解一些基本概念和历史变化，特别重视HER2低表达癌的新进展

Evolving concepts in HER2 evaluation in breast cancer: Heterogeneity, HER2-low carcinomas and beyond.

乳腺癌HER2评估概念的演变：异质性、HER2低表达癌及其未来（一）

Marchiò C, Annaratone L, Marques A, Casorzo L, Berrino E, Sapino A.

Semin Cancer Biol. 2021 Jul;72:123-135. doi: 10.1016/j.semcancer.2020.02.016. Epub 2020 Feb 26.

PMID: 32112814

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https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1044579X20300493?via%3Dihub#bib0525

摘要

人表皮生长因子受体2（HER2）是众所周知的乳腺癌不利预后因素，也是曲妥珠单抗和其他抗HER2化合物的靶点。90年代HER2阳性乳腺癌的开创性研究打开了临床研究和肿瘤学实践的新纪元，重塑了该疾病的自然史。在诊断病理学中，HER2状态通常通过免疫组织化学（IHC，评估HER2蛋白表达水平）和原位杂交（ISH，评估HER2基因状态）的组合进行评估。为此，国际建议是由该领域专家的一致意见制定的，多年来，根据新的实验和临床数据，这些建议发生了变化。在这篇综述文章中，我们将记录有助于更好地评估临床实践中HER2状态的变化，此外，我们将讨论IHC和ISH以及转录组学分析定义的HER2异质性，批判性地描述HER2不确定结果的复杂性。最后，我们将介绍HER2突变的临床影响，并根据新出现的关于特定抗HER2药物在缺乏HER2扩增所决定的经典癌基因增加的乳腺癌亚组中的疗效的临床数据，定义即将出现的HER2低表达乳腺癌类别。

关键词：HER2；Amplification；Mutation；HER2-low；Heterogeneity

1、简介

人表皮生长因子受体2（HER2）是一种孤儿酪氨酸激酶受体，属于人表皮受体家族。HER2没有配体，但HER2是该家族其他三种受体的首选二聚化伙伴¹。受体之间（同源/异源）二聚后，下游酪氨酸激酶信号级联被激活，从而触发细胞增殖、迁移、侵袭和存活¹。

HER2扩增导致约15%的乳腺癌中HER2过度表达²。这种机制一方面导致不良预后（由于对细胞增殖、迁移、侵袭和生存的影响，所有癌症的标志），另一方面，它提供了一种独特的可能性，可以使用单克隆抗体曲妥珠单抗进行靶向治疗，曲妥珠单抗的靶向是HER2的细胞外结构域，从而改变正常的酪氨酸激酶信号（图1）。自90年代以来，这种治疗选择从根本上改变了HER2阳性疾病的自然史。除外单克隆抗体曲妥珠单抗（目前在新辅助、辅助和转移情况下与化疗一起使用），多年来还研发了其他抗HER2治疗化合物（图1）。Pertuzumab是一种人源化单克隆抗体，在与曲妥珠单抗不同的结构域上与HER2结合，并防止同源和异源二聚体的形成，作为晚期疾病一线治疗的首选方案，Pertuzumab被常规添加到紫杉烷和曲妥珠单抗方案中³，并且它也在新辅助治疗中使用⁴。其他抗HER2化合物（酪氨酸激酶抑制剂，如拉帕替尼，或抗体药物结合物，如T-DM1）主要用于转移或临床研究。值得注意的是，尽管过去几年中已在HER2阳性疾病中确定了几个具有预后价值的标志物，但目前抗HER2药物可能有治疗反应的最佳预测因素是HER2过度表达/扩增⁵。

图1 HER2下游通路激活，抗HER2靶向药物。HER2是一种配体-孤儿跨膜酪氨酸激酶受体，属于人类表皮受体（HER）家族。HER2与其他三种受体（HER1或EGFR、HER3和HER4）中的一种同源或异源二聚，触发与癌细胞增殖、侵袭和存活相关的不同信号通路的激活¹¹⁰⁶。基于HER2激活调节的治疗方法包括蛋白质的不同靶点。单克隆抗体结合HER2的细胞外结构域，对曲妥珠单抗或pertuzumab具有选择性抗原偏好，导致信号级联减少¹⁰⁷。抗体-药物偶联物被设计为在肿瘤细胞内化后释放药物，以减少全身副作用。小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI），如拉帕替尼和奈拉替尼，通过对激酶结构域ATP结合位点的特异性，分别以可逆或不可逆的方式抑制HER2受体的催化活性¹⁰⁸。ADC：抗体药物结合物。

在诊断病理学中，HER2状态通过免疫组织化学（IHC，评估HER2蛋白表达水平）和原位杂交（ISH，评估HER2基因状态）的组合进行常规评估，这是仅有的两种获得公认临床验证的技术^2,5,6。为此，根据该领域专家的共识制定了国际建议。根据新的实验和临床数据，这些建议多年来有所改变。在这篇综述中，我们将记录有助于更好地评估临床实践中HER2状态的变化；此外，我们将讨论不同的场景，包括IHC和ISH以及转录组学分析定义的HER2异质性、HER2不确定结果的复杂性、HER2突变和即将出现的HER2低表达乳腺癌类别。

2、ASCO/CAP指南对乳腺癌HER2的评估

在诊断实践中，每个新诊断的乳腺癌以及任何复发或转移的乳腺癌都要评估HER2状态，根据该领域的国际专家组的建议进行HER2状态的评估。自2007年以来，美国临床肿瘤学会/美国病理学家学会（ASCO/CAP）起草了HER2检测建议⁷，并仔细讨论了使用IHC和荧光ISH（FISH）进行HER2检测的性能和解释的最佳分析前和分析要求。分析前阶段对IHC和ISH的正确性能有巨大影响，适当控制冷缺血时间对于确保福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中抗原、DNA和RNA的保存至关重要^2,8-10。

曲妥珠单抗的初始临床试验使用IHC评分3+，或评分2+以及阳性FISH试验（定义为>50%的肿瘤细胞中HER2/CEP17比值≥2），作为纳入标准。在这些试验中，IHC评分3+定义为在>10%的肿瘤细胞中出现强烈的完整的细胞膜染色，2+定义为在>10%的肿瘤细胞中出现弱到中度的完整的细胞膜染色¹¹。在2007年ASCO/CAP指南中，IHC检测时肿瘤细胞的阳性阈值提高到30%以上，FISH检测时HER2/CEP17比值也提高到≥2.2，以减少假阳性结果的数量，减少无效抗HER2治疗的使用⁷。

2009年，ASCO/CAP对2007版FISH检测指南中HER2异质性进行了补充。它将HER2基因异质性定义为：使用双探针时，≥5%至<50%的浸润性肿瘤细胞的比值≥2.2，或使用单探针时，HER2信号≥6/细胞¹²。建议在扫描整个玻片以寻找异质性后，选择并评估浸润性肿瘤的2-4个代表性区域；FISH检测到成簇（>20个细胞）HER2扩增时，应当按照HER2/CEP17比值和/或HER2信号/细胞进行单独评估和报告¹²。

2013版ASCO/CAP指南将阳性阈值恢复为当初的IHC检测中肿瘤细胞>10%，FISH检测中HER2/CEP17比值≥2，以避免假阴性结果¹³。这些建议引起了人们对假阴性结果的关注，假阴性结果可能会乳腺癌患者失去潜在挽救生命的治疗机会（抗HER2治疗）¹³。这一立场是基于这种治疗可能导致的副作用频率相对较低¹³。特别是，这些指南引入了ISH流程图的概念，在对ISH结果进行评分时，首先考虑HER2/CEP17比值，然后分析HER2/CEP17比值<2时的HER2平均拷贝数，这代表一种两步评估方法。在17号染色体着丝粒区（CEP17）拷贝数异常的情况下，这种评估方法有助于避免HER2扩增的错误分类。事实上，我们¹⁴和其他人^15-17已经证明，具有这种FISH模式的乳腺癌更频繁地存在真正的HER2扩增和17号染色体着丝粒区的获得/扩增，而不是17号染色体（Chr17）多倍体。

最后，2013年ASCO/CAP建议通过采用IHC评估中使用的大于10%的相同阈值，进一步解决了HER2异质性问题，从而将HER2异质性定义为存在具有不同HER2拷贝数和/或HER2/CEP17比值的单独细胞群，至少占整个肿瘤细胞群的10%¹³。指南建议，在这些情况下，至少应在其中20个细胞中进行单独计数¹³。

2018年，ASCO/CAP专家组成员提供了这些指南的更新，重点是五个具体的临床问题（表1）⁶。在这方面，2018年ASCO/CAP指南最好被视为2013年版的整合，而不是一个新版本。未修改截断值，亦未修改定义，而是对文献数据进行了回顾，以评估临界病例的阳性或阴性结果的证据水平。

作为要回答的第一个问题，专家组成员的重点是需要反馈性ISH测试的2分以上乳腺癌的正确定义：需要在超过10%的肿瘤细胞群中呈现弱到中度的完全膜染色，才能将乳腺癌分类为2+。然而，众所周知，可能遇见HER2表达的少见模式，例如，具有强而不完全的膜染色（典型的微乳头状癌），或强而完全的染色但仅占整个肿瘤群不到10%的细胞亚群中。在所有这些情况下，必须执行ISH。在后一种情况下，这表明肿瘤内异质性很高，合理的常见做法包括测试额外的肿瘤蜡块，以评估HER2过度表达/扩增的真实程度。由于HER2扩增克隆可能占主导地位，因此导致加用抗HER2治疗，这些高度异质性的癌最可能从复发和/或转移进展的再次检测时获益。

第二个临床问题与2013版提出的强制性建议有关，即当粗针穿刺活检标本在初始评估HER2结果为阴性时，应在手术标本上重复进行HER2测试。2018更新版修正了这一说法，建议每当遇到以下情况之一时，可以重复HER2检测：i）粗针活检标本中的浸润性肿瘤数量较少；ii）切除标本含有高级别癌，其形态与粗针区不同；iii）经ISH和IHC检测后，HER2的粗针活检结果不明确；iv）对粗针活检标本的处理存在疑问（缺血时间长、固定剂使用时间短、固定剂不同），或者病理学家根据检测错误认为阴性检测结果是可疑的⁶。

其余三个临床问题与ISH结果有关，建议参考2016年Press及其同事提出的5组分类¹⁹。第1组（HER2/CEP17比值≥2，HER2拷贝数>4）和第5组（HER2/CEP17比值<2，HER2拷贝数<4）代表了HER2评估谱的两个极端（分别存在和缺乏HER2扩增），作者指出，这将占所有双探针ISH测试结果的95%。剩下的5%将被归类为第2-4组⁶，其特点是非单一解释的挑战性场景，多年来一直存在争议，2018年ASCO/CAP更新版建议在综合重新解释ISH和IHC分析的基础上进行额外的研究，以达到最准确的HER2状态结果（阳性与阴性）（表1）。

特别是，第2组确定了ISH检测结果显示HER2/CEP17比值≥2但平均HER2拷贝数<4的肿瘤，这一模式通常反映了17号染色体单体的存在。在对曲妥珠单抗初始临床试验的回顾性分析中，虽然该组样本量较小，无法从统计学上排除治疗可能带来的获益，但大多数患者似乎没有改善抗HER2治疗的结果⁶。因此，如果在额外检查期间确认ISH模式，建议将这些病例视为阴性，除非IHC显示肿瘤细胞评分为3+⁶。

在第3组中，我们包括携带平均HER2拷贝数≥6和因CEP17拷贝数增加而导致HER2/CEP17比值<2的病例，由于采用ASCO/CAP 2013算法，结果记为阳性。这些病例非常罕见（0.4–3%），未包括在曲妥珠单抗的初始临床试验中，因此关于含曲妥珠单抗化疗的获益的临床证据有限。然而，根据多个独立小组对这些病例中发生真正HER2扩增的证明^14-17，尤其是当HER2拷贝数较高时，2018年更新版支持对这些肿瘤的HER2阳性定义，除非缺乏HER2过度表达（即标本显示IHC评分为1+或0）⁶。

最后，第4组乳腺癌显示可疑的HER2基因状态（HER2/CEP17比值<2.0，平均HER2拷贝数≥4且<6），如果IHC也显示HER2表达评分为2+，则定义为HER2双重不确定。实验室内此类病例的数量因ISH检测所涉及的患者群体而异，但似乎约占病例的5%（范围：1%-16%）⁶。根据2013版建议，携带这种ISH模式的乳腺癌被标记为“可疑”，抗HER2药物的使用由临床医生选择¹³。毫无疑问，第4组病例对肿瘤学家和患者构成了挑战，因为他们对是否推荐HER2靶向治疗存在矛盾心理。还应注意的是，由于没有明确的阳性或阴性检测结果，导致对同一组织样本进行多次检测，并使用替代的Chr17探针检测来解决HER2状态。重要的是要强调乳腺癌中的Chr17是高度重现性改变的概念^14,20,21，因此，在这些情况下，使用其他Chr17探针映射到与CEP17不同的区域可能会产生误导，而不是提供支持：例如，通过使用映射到短Chr17臂的探针，该臂恰好含有大量染色体丢失，HER2/Chr17探针比值可能会增加，甚至会导致仅基于人工计算的阳性结果。此外，这些Chr17替代探针未经分析或临床验证，即它们未用于显示抗HER2治疗疗效的临床试验⁶。2018年ASCO/CAP更新版的专家组也强烈建议不要将其作为常规测试策略，并建议如果没的进行重复HIS检测并由另一名观察人员重新计数，则依靠IHC评分的重新评估⁶。如果在额外ISH检查后证实了双重不确定的结果，则该癌优先标记为阴性，因为在没有蛋白过度表达（IHC评分3+）的情况下，患者是否可能受益于HER2靶向治疗尚不确定⁶。应该注意的是，尽管其潜在获益的影响缺乏了解，但这项建议设想对于每个细胞的平均HER2信号≥4.0且<6.0和HER2/CEP17比值<2.0的患者是可能获益的。NSABP B-47试验最近证明，HER2阴性癌（IHC评分1+/2+，ISH阴性）不受益于加用曲妥珠单抗²²。遗憾的是，这项研究没有包括HER2状态不确定的癌，因此缺少关于这些癌治疗反应的数据。

毫不奇怪，到目前为止关于2018版指南影响的研究表明，新指南的应用导致HER2测试的阴性率增加。这一观察结果源于对第2组和第4组病例的重新分类，现在建议将其评分为阴性^23,24。

3、HER2阳性乳腺癌的肿瘤内和肿瘤间异质性

在包括乳腺癌在内的各种类型的人类癌症中，肿瘤内遗传异质性已得到充分证明²⁵。在诊断实践中常规评估HER2的病理学家早已熟知HER2过度表达和扩增可能呈现异质模式（图2）。已经描述了具有异质性HER2状态的三种不同类型的细胞分布²⁶：“簇集”型，特征是不同部位存在两种不同的肿瘤细胞克隆，一种携带HER2扩增，另一种具有正常HER2状态；“马赛克”型，显示不同HER2状态细胞的弥漫性混合；“分散型”，在HER2阴性肿瘤细胞群中有分离的HER2扩增细胞。

图2 HER2表达的肿瘤内异质性。通过免疫组织化学评估乳腺癌中HER2蛋白表达异质性模式的代表性显微照片。A 一个样本显示了两个不连续的肿瘤克隆，其中一个显示HER2表达（评分3+），另一个缺乏HER2过度表达，并夹杂一些孤立性HER2阳性细胞（插图）。B 具有不同程度HER2表达的乳腺癌，某些区域得分为2+（虚线），其他区域得分为1+（点线）。C 样本中聚集的HER2评分2+细胞（箭头）被HER2评分1+细胞包围。D HER2评分1+肿瘤细胞群中散在的HER2评分2+细胞（箭头）。图像来自常规分析用于HER2评估的样品，并签署研究知情同意书。

几项研究表明，在乳腺癌中，HER2基因异质性的存在频率变化很大（1-34%）^27-36，在ISH和/或IHC对HER2状态不确定的病例中更为常见^{27,30,33,34,37}。例如，Allison等人²⁷和Chang等人²⁹发现，90%以上的FISH HER2不确定病例呈现HER2异质性；Bukley等人观察到，HER2边界线病例以及HER2/CEP17比值最高的HER2阴性病例的异质性水平最高¹⁸。一些人认为HER2异质性是FISH和IHC导致乳腺癌的可疑HER2结果的重要原因^18,36,37。在这方面，我们的研究小组已经证明，每当评估HER2扩增细胞和非扩增细胞弥漫混合的乳腺癌中的HER2状态时，都会导致HER2计数不明确³⁸。这些病例的典型特征是HER2扩增水平较低³⁸，其他病例也观察到了这一点^28,33,36,39。

一些研究还将17号染色体多倍体性频率的增加与HER2异质性联系起来^37,39,40。如前所述，17号染色体多体性在乳腺癌中是一种罕见的事件，其特征是17号染色体着丝粒（CEP17）^14-17更频繁地增加或扩增。因此，在这种情况下应使用术语CEP17异常拷贝数（尤其是在间期核中通过FISH评估时）。然而，这种在HER2异质癌中独立观察到的CEP17拷贝数增加的现象可能支持以下理论，即HER2异质性至少部分是由染色体不稳定性引起的⁴⁰。

就对患者预后的影响而言，Shafi等人³⁷发现，具有遗传异质性的HER2-FISH非扩增肿瘤与体积较大较大、组织学分级较高和淋巴结转移频率相关，这是乳腺癌重要的不利预后因素。几项研究表明，HER2异质性的存在与患者的无病生存期和总生存期较短有关，这与患者的预后较差有关^32,33,40。在分析对治疗的反应时，HER2异质性患者似乎对抗HER2靶向治疗反应较低^30,41-43，这也可以通过含曲妥珠单抗的化疗新辅助治疗后病理完全反应（pCR）的较低来证明^35,38。这些结果最近在2019年ASCO会议上由Metzeger Filho及其同事提出的一项优秀的研究中得到了证实，他们设计了一项II期研究，其中对II期和III期HER2阳性乳腺癌对新辅助性T-DM1和pertuzumab的反应进行了评估。诊断性粗针穿刺活检样本中的HER2异质性定义为：i）FISH检测，>5%且<50%的肿瘤细胞呈HER2阳性¹²；ii）肿瘤有一个区域的检测结果为阴性。10%的病例发现HER2异质性（n=16/157）。与没有HER2异质性证据的HER2阳性癌获得55%的pCR相比，在任何异质性病例中均未实现pCR。当通过雌激素受体（ER）状态进行调整时，HER2异质性与pCR之间的关联仍然显著。这些数据表明，HER2异质性乳腺癌可能是HER2阳性肿瘤的一个独特亚类，可以考虑采用不同的治疗方法⁴⁴。

一项基于基因拷贝数分析和大规模平行测序的研究中，分别检测12例HER2异质性乳腺癌HER2阴性和HER2阳性成分，确定了每个病例中仅限于HER2阴性细胞的潜在驱动基因改变。体外模型显示，BRF2和DSN1过度表达/扩增以及HER2 I767M突变，可以弥补HER2异质性乳腺癌HER2阴性成分中HER2扩增不足的缺陷⁴⁵。

另一个需要考虑的重要方面是HER2阳性疾病的肿瘤间异质性。首先，高达45%的病例也可能表达不同水平的激素受体；第二，分子亚型的组成各不相同；最后，在肿瘤中可以观察到不同的基因改变。

虽然激素受体状态似乎不能决定HER2扩增乳腺癌的总体遗传特征，但特定的遗传学异常可能是HER2阳性乳腺癌亚组的特征^46-48。激素受体状态也至少部分影响临床定义（即IHC/FISH）HER2阳性癌固有分子亚型的分布。绝大多数为HER2丰富型癌，但管腔型癌（管腔B比管腔A更普遍）和基底样癌的数量不容忽视^46,49,50。

值得注意的是，通过转录组学分析定义为“HER2丰富”的HER2阳性乳腺癌，对抗HER2治疗有很高的反应率，因此确定了一类对抗HER2化合物有超级反应的乳腺癌^50,51。Prat及其同事⁵²最近在使用双HER2阻断不用化疗的五项新辅助临床试验（SOLTI-PAMELA、TBCRC023、TBCRC006、PER-ELISA、EGF104090）中，通过PAM50分析了HER2阳性疾病中HER2 mRNA水平和HER2丰富的固有亚型。与其他类型相比，PAM50定义的HER2丰富的固有亚型与高HER2 mRNA水平和高pCR率显著相关⁵²。这些数据表明，这种生物标记物可以帮助约40%的HER2阳性乳腺癌患者降低化疗水平⁵²。

事实上，HER2扩增患者的不同内在亚型之间存在着广泛的患者间差异。在一组通过全基因组测序分析的66例HER2扩增乳腺癌中，仅在以PAM50衍生的HER2丰富亚型为特征的肿瘤中检测到TP53突变，而PI3KCA基因没有任何改变。相反，归类为管腔型的乳腺癌显示PIK3CA突变频率较高，且无TP53改变⁴⁶。有趣的是，与PIK3CA野生型肿瘤相比，在接受新辅助蒽环类紫杉烷化疗加抗HER2治疗的HER2阳性肿瘤队列中，PIK3CA突变癌（占整个队列的21.4%）不太可能实现pCR。对于激素受体阳性癌，PIK3CA野生型和PIK3CA突变肿瘤之间的pCR率差异更为显著⁵³。

Zhao及其同事报道，与HER2阳性/ER阴性乳腺癌相比，一系列HER2阳性/ER阳性乳腺癌显示预后较好而对曲妥珠单抗的获益减少，TP53突变率降低，HER2在mRNA水平和蛋白质水平的表达程度较低⁵⁴。

未完待续