DNA错配修复缺陷(ｄMMR)是被美国食品和药物管理局(FDA)批准的首个不限肿瘤原发部位的生物标志物【1】。在临床中，肿瘤组织样本的免疫组化(IHC)是dMMR检测推荐的标准一线筛查工具【2】。准确检测癌症患者的MLH1蛋白缺失，对临床治疗方案的确定至关重要。但由于染色平台、抗体克隆、染色体系和质量控制(QC)材料的差异，IHC检测室间评价一致性不佳【3】。IHC是一个多步骤的过程，受到包括抗原修复、抗体和显色试剂的选择、孵育时间、洗涤等多种因素的影响，建立一种具有良好特性、可大量使用的新型FFPE QC材料，有助于实现IHC临床检测的标准化。
国家卫生健康委临床检验中心副主任兼临床分子与免疫室主任李金明教授团队利用CRISPR/Cas9编辑方法构建了dMMR细胞系和细胞系异种移植模型，通过细胞系和异种移植模型制备FFPE样本，作为免疫组化临床检测标准化的新型质量控制（QＣ）材料。该成果发表在《JOURNAL OF CLINICAL LABORATORY ANALYSIS》杂志。
研究者针对MLH1基因的外显子的4个不同区域设计了4条sgRNA，通过T7EI检测筛选出MLH1sgRNA-4的切割效率效率最高（图1）。在人B淋巴GM12878细胞系中利用CRISPR/Cas9系统敲除MLH1基因，通过流式细胞术进行sgRNA转染阳性细胞筛选。
图1 T7EI检测MLH1sgRNA的裂解效率
研究者对960个sgRNA转染阳性单细胞进行培养，培养成功358个单克隆，细胞存活率为37.3%（358/960）。分别通过Sanger测序、WB和NGS测序在DNA水平和蛋白水平筛选阳性的单克隆细胞，发现存在两种MLH1基因缺失的纯合子单克隆细胞株。并采用IHC方法，以HCT116和GM12878Cas9细胞系作为阴性和阳性对照，进一步验证了这两种MLH1蛋白缺陷细胞系，核染色与预期一致（图2A）。
图2 IHC检测单克隆细胞株
研究人员将MLH1蛋白缺陷细胞移植到雌性NOD-SCID裸鼠体内，肿瘤体积在3周的时间内增长到约1000mm3。将移植瘤组织制备的FFPE样本，采用H&E和IHC染色法进行鉴定，以确定MLH1蛋白缺陷细胞株异种移植瘤FFPE样本是否与临床样本相似。
图3 HE和IHC检测MLH1蛋白缺陷细胞株异种移植瘤FFPE样本与子宫内膜癌患者的临床标本的组织学结构
H&E染色结果显示，MLH1蛋白缺陷细胞株异种移植瘤FFPE样本具有典型的组织学结构，类似于子宫内膜癌患者(（图3C）)的肿瘤浸润、炎症、出血、组织坏死和肿瘤浸润，一致性比例从40%到70%。
国家卫生健康委临床检验中心的研究充分证明了：利用CRISPR/Cas9系统构建的MLH1基因突变细胞株异种移植瘤FFPE样本，是作为临床的dMMR IHC检测的新型质控品的理想材料，具有性能与病理组织样本相一致，并克服了现有病理组织样本存在异质性、无法实现大量生产的局限性。
百凌生物以”推动中国病理片片有质控”为理念，成功建立了基于基因编辑单克隆细胞株构建平台，为病理科室提供具有细胞真实形态、操作简便的液态细胞质控品，为病理诊断提供特异性、敏感性经验证的抗体产品及带有质控体系的自动化染色设备。
目前，百凌生物已建立了MLH1蛋白缺陷细胞株以及MLH1蛋白表达细胞株，制备出可用于dMMR-MLH1检测的液态细胞质控品。
MLH1表达-阳性液态细胞质控品 MLH1缺失-阴性液态细胞质控品
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【1】Marcus L, Lemery SJ, Keegan P, et al. FDA approval summary: pembrolizumab for the treatment of microsatellite instability-high solid tumors. Clin Cancer Res. 2019;25(13):3753-3758.
【2】 McCarthy AJ, Capo-Chichi JM, Spence T, et al. Heterogenous loss of mismatch repair (MMR) protein expression: a challenge for immunohistochemical interpretation and microsatellite instability(MSI) evaluation. J Pathol Clin Res. 2019;5(2):115-129.
【3】 Müller W, Burgart LJ, Krause-Paulus R, et al. The reliability of immunohistochemistry as a prescreening method for the diagnosis of hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC)–results of an international collaborative study. Fam Cancer. 2001;1(2):87-92.
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