当发现可疑肺结节时，通过支气管镜活检是诊断肺癌有效的方法之一。但有时因为肿瘤大小或部位等因素，不能获得足够的组织或细胞学标本。另一方面在细胞学病理诊断中，一些不典型细胞与肿瘤细胞的鉴别有难度。对于这个问题，近日Yusuke Araki医生等人探讨了检测液基细胞学标本中MicroRNA（MiRNA）的表达在诊断原发性肺癌中的效果。我们将该研究要点编译如下：

MiRNA是由22个核苷酸组成的非编码小RNA，在调节基因表达过程中发挥重要作用。该文献提多诸多研究表明MiRNA在肿瘤诊断中具有重要意义。例如Xie等人的研究显示MiR-21在肿瘤患者中的表达高于非肿瘤患者。Huang等人的研究显示支气管刷标本中MiR-29a及MiR-375的表达水平可以准确区分小细胞肺癌和非小细胞肺癌，支气管刷标本中MiR-34a和MiR-205的表达可以准确区分肺鳞癌和肺腺癌。但很少有研究探讨细胞学标本的诊断价值。因此作者提出能否通过检测液基细胞学标本中相关MiRNA的表达来诊断肺癌。该团队查阅了大量文献，最终选择了MiR-21,MiR-31，MiR-182，MiR-183，四个MiRNA作为研究对象。

研究对象和方法

1.组织标本收集

收集18例肺癌手术切除标本的肿瘤组织及肿瘤周围正常组织。统计18名患者的临床病理特征如表1所示。

2.细胞学标本的收集与筛选、分类

收集136例支气管灌洗液液基细胞学标本。在收集的136例标本中，有2例因为细胞量太少被排除，4例因为是转移癌不是原发肺癌而被排除，另外5例因为提取出的RNA量太少不满足检测需要而被排除。最终筛选出125个细胞学标本进行病理学诊断和RT-qPCR检测（图1）。统计125名患者的临床病理特征如表2所示。随后根据病理诊断（包括细胞学和组织学诊断）分为肿瘤组（83例）和非肿瘤组（42例）。在83例肿瘤组的标本中有40例初步细胞学诊断为良性（27例）或性质不明确（13例），但结合组织学诊断后均为恶性肿瘤并归于肿瘤组。42例非肿瘤组中有2例初步细胞学诊断为性质不明确，结合组织学诊断明确为良性并归于非肿瘤组。细胞学诊断与组织学诊断的关系如表3所示。

图1.液基细胞学标本的筛选和qRT-PCR检测MiRNA。根据最终病理诊断结果分为肿瘤组和非肿瘤组。

RNA提取及RT-qPCR

参见原文。

数据分析

数据分析选择JMP Pro14.1.0。患者之间MiRNA表达的不同采用Mann-Whitney检验（两组非配对资料秩和检验）。ROC曲线（receiver operating characteristic curves）及AUC值（area under the curve analyses）用来评估每一个MiRNA在诊断中的敏感性和特异性。P＜0.05被认为有统计学意义。

结果

1.肺癌组织与周围正常肺组织对比

18例手术切除标本中肺癌组织中4种MiRNA的表达均高于周围正常肺组织。结果如图2所示。

图2.18例手术切除标本中肺癌组织中4种MiRNA的表达均高于周围正常肺组织。A、B、C、D分别为MiR-21 、MiR-31、 MiR-182、 MiR-183（T：肿瘤组，N：非肿瘤组）

2. 细胞学标本检测结果

在125例细胞学标本中分别检测MiR-21，MiR-31，MiR-182，MiR-183，其中125里标本均可检测出MiR-21，123个标本中检测出MiR-31，109个标本检测出MiR-182，102个标本检测到MiR-183。有96个标本可同时检测出四种MiRNA（图1）。

肿瘤组的MiRNA的表达高于显著高于非肿瘤组（图3）。在初步细胞学诊断为良性和性质无法确定的40恶性病例中，四种MiRNA的表达也显著高于非肿瘤组（图4）。

在96个可同时检测出四种MiRNA的标本中，有54例初步细胞学诊断为良性，最后结合组织学诊断有24例明确为恶性。在这54个病例中进行分析，当细胞学判读为良性时，MiRNA的诊断价值。结果显示MiR-21、MiR-31、MiR-182、MiR-183的诊断价值分别为0.676、0.683、0.688、0.772。对与细胞学判读为良性的标本，联合四个指标的诊断价值为0.810，显著高于四个指标单独使用（图5）。

图3.125例液基细胞学标本中肿瘤组四种MiRNA表达水平高于非肿瘤组。A、B、C、D分别为MiR-21 、MiR-31、 MiR-182、 MiR-183（T：肿瘤组，N：非肿瘤组）

图4.82例初步细胞学诊断为良性或性质不明确的标本中。最终诊断为肿瘤的病例其四种MiRNA表达水平均高于最终诊断为良性病变的病例。A、B、C、D分别为MiR-21 、MiR-31、 MiR-182、 MiR-183（T：肿瘤组，N：非肿瘤组）

总结

该研究团队通过实验表明可以通过提取细胞学样本中的RNA进行检测。并且所研究的四种MiRNA：MiR-21 、MiR-31、 MiR-182、 MiR-183在肿瘤患者中的表达显著高于非肿瘤患者。有望通过支气管镜获得的细胞学标本，通过进行RT-PCR来检测MiRNA的表达水平来提高肺癌的诊断率。

但是在文章的讨论部分，作者也直接提出了他们仍然存在的不足和疑问。第一：虽然肿瘤病例中相关MiRNA的表达上调，但细胞学诊断为良性、性质不明确、可疑恶性三类病例中相关MiRNA的表达无明显差异。第二：通过支气管灌洗获取的液基细胞学样本中，含有多种细胞，包括炎症细胞、上皮细胞、红细胞，而且不同样本中所含的细胞成分也可能不全相同。当肿瘤病例的细胞学样本中含有的肿瘤细胞很少时，很难通过MiRNA表达水平的不同来与非肿瘤病例进行区分。第三：目前没有专门用于细胞学标本的RNA提取试剂盒，在该研究中，作者选择了用于培养细胞的RNA提取试剂盒。第四：该研究中选择的MiR-182、MiR-183虽然被认为是致癌基因，但也有研究表示他们具有抑癌效果。

图5.在细胞学诊断为良性的标本中单独检测四个MiRNA与联合检测的诊断价值。（A）MiR-21：0.673、（B）MiR-31：0.683、（C）MiR-182：0.696、（D）MiR-183：0.769、（E）联合四种MiRNA：0.810

参考文献：

Araki Y ,  Arihiro K ,  Yamaguchi K , et al. Analysis of microRNA Expression in Liquid-Based Cytology Samples May Be Useful for Primary Lung Cancer Diagnosis[J]. American Journal of Clinical Pathology, 2021.