综述：先天性巨结肠的诊断（一）

综述：先天性巨结肠的诊断（二）

【病理诊断】

诊断HSCR的外科病理学方法与活检技术同步发展。虽然用于诊断HSCR的方法很多，目前常用的是在HE染色基础上用免疫组化方法检测钙视网膜蛋白（Calretinin，CR）等标记物和酶组织化学染色检测乙酰胆碱酯酶（AchE）。在病理诊断之前，我们先了解一下正常肛肠解剖学。

【1】正常肛肠解剖（Normal Anorectal Anatomy）

为了解释直肠黏膜活检结果，了解正常的肛门直肠解剖是非常重要的。不幸的是，由于肛肠管内标志物的定义和命名不一致，这一问题变得复杂起来。Claus Fenger对这个主题写了一篇很好的评论，他的结论是这里使用的解剖学术语的基础（图4）。

图4：A，肛门直肠解剖图示以说明包括肛管在内的关键标志物，肛管延伸肛门内括约肌的长度，上部被覆结肠黏膜，下端被覆鳞状上皮，中间为肛门过度区/移行区黏膜上皮。B，通过肛管的纵向组织学切片（三色染色）显示黏膜下（C）和肌间（D）神经节细胞。

缩写词：ext.：外部（external）； int.：内部（internal）；m.：肌层（muscularis）；sph.：括约肌（sphincter）；

多项研究表明，神经节细胞的密度在正常直肠下端减少。这些现象导致了生理性低位直肠区或者可能是无神经节细胞症的概念，并且建议在该区域附近活检排除HSCR。Aldridge 和Campbell建议至少在肛门瓣膜上方2厘米处[齿状线]；其他的明确规定在皮肤黏膜交界处/肛缘>2厘米以上处。这些建议的目的是防止超短无神经节细胞肠段出现假阴性诊断结果。Aldridge 和Campbell检查了20名患者尸体的肛门直肠标本，患者年龄从早产儿到15岁。对于每一个标本，经直肠远端和肛管手术的9个纵切面和9个横向半周断面（齿状线近端的0.5、1.5和2.5厘米，每个位置切3片）进行显微镜检查。这些切片厚5mm，HE染色。尽管在一些标本的3个纵切面上，在肛瓣底部（齿状线）和黏膜下神经节细胞之间发现了长达17mm的间隙，但在一些相应的横切面上，神经节细胞出现在距齿状线<5mm的位置。对2例标本进行连续切片H&E染色，定量分析4 mm长×10 mm厚的浅表黏膜下神经节细胞。同样，在齿状线以上0.5cm处，浅表神经节细胞存在但稀疏。根据这些和其他观察结果，Aldridge 和Campbell得出如下结论：①瓣膜上方0.5厘米处的末端（是齿状线，而不是肛缘）应被视为“神经节细胞稀疏区”（hypoganglionic）而不是无神经节细胞区（aganglionic）；②一些病例中，神经节细胞稀疏区被覆过渡（“中间”）上皮[transitional (‘intermediate’) epithelium]；③如果在黏膜下神经丛中发现神经节细胞，在肌间神经丛中也会有神经节细胞。

如上所述，大多数外科医生是在距肛缘至少2厘米以上处进行黏膜活检。选择标志物是至关重要的，因为当进行抽吸活检时，齿状线的位置是估计的，但看不到，而且根据患者的年龄，齿状线可能位于肛缘（皮肤黏膜交界处）上方1～9毫米处。在新生儿中，靠近齿状线2厘米的活检很可能在直肠黏膜中，并且可能在超短段型HSCR患者的过度区/移行区（transitional zone，TZ）中，而高于肛缘2厘米的活检可能接近肛管顶部，并且可能在肛门移行区。此外，由于过度区/移行区上皮（transitional epithelium）与大肠黏膜的界面不规则，不同个体之间的管内不同区域的长度差异很大。在多个层面（如肛门边缘近端2、3、4cm）进行抽吸活检的一个原因是减少所有活检组织检查要么过低（transitional mucosa）或太高的可能性。

【2】直肠抽吸活检（Suction Rectal Biopsy）

经直肠抽吸活检确诊或排除HSCR取决于以下因素：①明确的神经节细胞的鉴定（图5）：

对于有经验的病理医生来说，在HE染色切片中识别神经节细胞并不困难，特别是在切片质量良好的情况下。典型的细胞学特征包括丰富的细胞质、偏心的圆形细胞核、明显的核仁、核周苍白和染色质位于外周。细胞学上未成熟的神经节细胞，细胞质少，核染色质斑点，核仁不明显，对于初学者来说可能是一个诊断挑战，特别是非常小的婴儿和早产儿。使用免疫组化可能是有帮助的。如果发现有神经节细胞，HSCR通常被排除，除非识别出是移行区（transitional zone，TZ），在这种情况下必须考虑超短段型HSCR。在极少数情况下，巨细胞病毒（CMV）感染可在非神经元细胞中产生，类似于成熟神经节细胞的细胞学改变（图6A）。通常存在一个大的或小的嗜酸性胞质病毒包涵体，这将CMV细胞病理学与神经元分化区分开来。无论是针对神经元特异性抗原（如Hu C/D，Phox2B）还是CMV特异性抗原（图6B）的免疫组化，都可以解决这个问题。更常见的情况是，仔细观察所有的组织切片，将确定明确的CMV细胞学形态，并允许两种诊断，HSCR和活动性CMV感染。

图5 神经节细胞：A至E，黏膜下神经节的典型H&E表现，显示不同分化程度的细胞学形态。许多明确的神经元（箭头）显示，细胞核圆形，染色质细颗粒。部分神经节细胞（N）可见胞浆，胞核偏位，Nissl体±明显核仁（A中星号）。相比之下，肠胶质细胞（g）染色质更浓缩，细胞核卵圆形，胞质边界不易识别。D和E所示的神经节用神经元细胞体特异性标记物anti-Hu进行免疫标记，该标记物突出了神经元（D'和E'）。

图6：在一例无神经节细胞的HSCR患者中，巨细胞病毒的细胞形态学类似于一个成熟的神经节细胞，黏膜下神经非典型细胞的H&E表现（A），巨细胞病毒特异性抗体阳性表达（B）。

②黏膜活检位置是否适当，如前所述，由于接近齿状线处1cm以内肠壁组织内节细胞稀少，取材部位以齿状线2～3cm为最佳。如条件允许，可间隔1～2cm多个部位取材以提高诊断率。③足够的黏膜下层：完全排除神经节细胞通常需要最大直径为2～3mm的抽吸活检和≥50%的黏膜下层（HE染色切片中，黏膜下组织的含量不宜少于1/3）。如果在没有免疫组化和酶组织化学染色的情况下，至少应有50～75个常规HE染色切面。如果没有发现神经节细胞，并且存在明显的黏膜下肥大神经丛，则可以确定诊断，无需进一步评估。不幸的是，一些活检缺乏这些明确的诊断结果，或具有非典型特征，需要进一步研究。

④黏膜下肥大神经丛：HSCR患者直肠黏膜下无神经节细胞，通常有许多肥大神经丛（图7）。1岁以下婴儿直肠中很少出现直径大于40微米的神经丛，但在老年患者的直肠中常见。在大多数患者中，显著的肥大神经丛（直径>40 微米）是一种可靠的诊断结果，但在一些全结肠无神经节细胞症（total colonic aganglionosis，TCA）患者中可能不存在。

图7：A，黏膜下增生肥大的神经丛（n）几乎总是存在于HSCR患者直肠中。B，这些大神经（n）周围表达Glut1，很容易与邻近血管中Glut1阳性红细胞（v）区分开来。C，1岁以下婴儿直肠中很少出现直径大于40毫米的神经丛，但在老年患者的直肠中常见。D，同样地，Glut1阳性神经丛出现在直肠远端时，在婴儿中较少（未显示）且较小。括号中为病例数。

缩写词：AC，升结肠；DC，降结肠；R，直肠；SC，乙状结肠；TC，横结肠。 

⑤辅助技术的应用：有经验的病理医生基于HE诊断/排除HSCR是相当可靠的，特别是在多个抽吸活检的多个切片中有足够的黏膜下层时。然而，当活检标本切片只有少量黏膜下或无神经节细胞但未见黏膜下肥大神经丛时，有必要应用（免疫）组织化学来帮助诊断。最广泛应用的辅助方法是AChE组织化学染色（图8）和免疫组化检测calretinin（图9-10）。对于新生儿的直肠黏膜活检，图11（来源文献：钙视网膜蛋白和乙酰胆碱酯酶在新生儿先天性巨结肠症直肠黏膜活检病理诊断中的应用）总结了诊断或排除HSCR的病理诊断流程。大龄儿童也可参考此流程。

图8：HSCR中AChE染色阳性，可见呈网格状的棕黄色神经纤维。

图9：HSCR中calretinin染色阴性，内对照肥大细胞阳性。

图10：非HSCR中calretinin染色阳性。

图11：新生儿直肠黏膜活检病理诊断流程图。

【3】直肠黏膜活检报告

直肠黏膜活检的外科病理报告至少应包括每次活检的位置和类型，是否发现神经节细胞或黏膜下肥大神经丛，以及任何辅助染色的结果。报告中诊断行的建议格式示例如下：

直肠黏膜，“距肛缘2厘米”，抽吸活检：

. 神经节细胞存在

. 无黏膜下肥大神经丛

. calretinin染色阳性

直肠黏膜，“距肛缘2厘米”，抽吸活检：与HSCR结果一致

. 未见神经节细胞

. 黏膜下可见丰富的肥大神经丛

. calretinin染色阴性

【4】常见的具有挑战性情况

基于直肠黏膜活检的HSCR诊断或排除诊断通常很简单。典型的病理表现包括神经节细胞缺失、黏膜下丰富肥大神经丛、calretinin染色阴性，以及异常丰富、粗大的胆碱能黏膜神经，如AChE组织化学染色所示。然而，在极少数情况下，可能出现难以解释或不一致的现象/结果，这可能是HSCR或相关的异常变化。如表1所示，这些“困难”病例可从其他办法中得到解决。

表1：直肠黏膜活检与HSCR诊断不明确或不一致的情况

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