[导读] 来源：生物探索
作为一种经典的实验技术，免疫组化（IHC）已成为实验达人的必备技能之一。IHC的实验流程和方法并不难，但在实验过程中存在许多变量，容易遇到各种问题，因此，想要做出漂亮的实验结果并非易事，正所谓“细节决定成败”。下面小编将简单介绍IHC的相关知识及在实验过程中经常遇到的问题和应对策略，从此，让成败与细节Say“拜拜”！
免疫组化（IHC）检测原理？
那么什么是免疫组化检测？它的检测原理是什么？在进行深度剖析前，一些重要知识需要了解一下。免疫组化检测即抗原-抗体的特异性结合反应以及显色反应。通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、同位素、酶等）显色来检测组织切片中的抗原，从而对其进行定位、定性和定量。
显色常用的酶为辣根过氧化物酶（HRP），常用的显色底物为DAB（3,3’-二氨基联苯胺），偶尔用AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）。碱性磷酸酶（AP或AKP）也是目前免疫诊断试剂最常用的标记酶之一，稳定性好、灵敏度高。
表1. 免疫组化（IHC）显色系统的选择
石蜡切片免疫组化（IHC）实验流程
那么，怎样做出漂亮的染色结果呢？小伙伴们，莫急！为了有一个全局概念，我们先来看一下石蜡切片免疫组化的实验流程吧！每一步都存在许多决定成败的小细节，它们可以是陷阱，也可以是获得好的实验结果的基石。
脱蜡水化不充分
脱蜡水化的目的是使组织恢复到固定后的状态，暴露抗原以便与一抗结合。通常用二甲苯或二甲苯替代物脱蜡，再用乙醇梯度洗脱二甲苯。若脱蜡和水化不全会引起染色不均匀（如下图）、产生非特异性背景着色等问题。脱蜡不足是免疫组化失败的最常见原因，原则上要彻底、完全脱去切片上的蜡。
内源性过氧化物酶
许多组织中存在内源性过氧化物酶，它通过与DAB结合而着色。在一抗孵育前，一般用3%H2O2灭活约10~20min，避免内源性过氧化物酶造成假阳性结果。H2O2需现用现配，且4℃避光保存，否则易引起非特异背景（如下图）。H2O2孵育时间过长也会易引起脱片。部分组织还含有内源性碱性磷酸酶,可用左旋咪唑进行灭活。
抗原修复
由于组织在甲醛或多聚甲醛固定过程中，会发生蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而掩盖抗原决定簇、失去抗原性。通过抗原修复，可以使细胞内的抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。抗原修复技术通常分为蛋白酶诱导的表位修复（PIER）和热诱导的表位修复（HIER）两大类。
在PIER方法中，蛋白酶K、胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶等蛋白水解酶可以使隐藏的抗原表位暴露，恢复其与抗体的结合。PIER的缺点在于恢复免疫反应性的成功率低，且有可能破坏组织形态和目的抗原。因此，需要选择性使用，严格控制浓度和作用时间。
HIER是在脱蜡入水后，将组织切片浸没在抗原修复液中并加热。修复液的主要成分为柠檬酸盐、三羟甲基氨基甲烷、去垢剂和螯合剂。最常用的修复液为pH 6~10的柠檬酸盐溶液和EDTA溶液。HIER对时间、温度、缓冲液和pH特别敏感，精确控制温度和时间是达到最佳修复的关键。总体来说，HIER的成功率比PIER高得多。
免疫组化染色的常见问题（部分）及对策
免疫组化（IHC）中存在的细节性问题“千千万”，每一种都有可能影响实验的成败，这里我们仅简单列举几种免疫组化染色中常见的问题和解决方法，如果想了解更多关于IHC的相关问题，可以持续关注我们。
表2.免疫组化（IHC）染色的常见问题（部分）及对策
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