【摘要】 在病理常规处理中富含脂肪的组织经常会出现脱水、透明不佳，导致制片不全、质量较差、切片困难等现象。乙醇和二甲苯被认为在组织处理环节起到脱水及透明的作用，但在传统流程中的实际效果往往不佳。我们通过把传统脱水、透明流程中使用的无水乙醇、二甲苯液改为无水乙醇、二甲苯液等量混合液进行脱水、脱脂、透明，取得了令人满意的效果。

病理组织制备环节中脂肪的处理一直是比较困难的事情，在传统观念中认为高浓度乙醇具有一定的脱脂作用。当处理含有大量脂肪的组织时建议延长高浓度乙醇的处理时间，以期得到好的结果，但最终往往不能令人满意。二甲苯一直被认为是一种媒介试剂，既能与乙醇混合又能溶解

石蜡，所以起到置换乙醇、接引石蜡的媒介作用，在这一过程中组织块内的乙醇最终被二甲苯所取代。我们探讨了乙醇和二甲苯在组织脱水、脱脂中的作用，并在浙江大学医学院附属第一医院和北京大学肿瘤医院同时进行实验，采用无水乙醇与二甲苯1∶1混合的方式进行组织处理，利用乙醇与二甲苯协同作用，脱水、脱脂共同进行，得到了满意的结果，现介绍如下。

一、材料与方法

1.材料、试剂和设备：材料包括经过提取的猪油、286块不同部位的手术标本组织、脱水机内经过试剂及沉淀物。试剂包括75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇和二甲苯。设备包括达科为全封闭脱水机、樱花全封闭脱水机、克拉泰切片机和徕卡2235切片机。

2.方法：实验1：取相同质量的提炼动物脂肪（猪油），分别加入95%乙醇、无水乙醇和二甲苯，观察猪油不同时间段的变化情况。实验2：将富含脂肪的人肠系膜及结肠组织经3.7%中性缓冲甲醛固定16 h后，直接放入75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯、无水乙醇和二甲苯（1∶1）混合液中，放置最长24 h，观察组织以及试剂的变化。实验3：将286块含脂肪的人体胃肠及乳腺组织手术标本均分为两份，一份按照传统流程处理：标本置于75%乙醇60 min、85%乙醇60 min、95%乙醇（Ⅰ）120 min、95%乙醇（Ⅱ）120 min、无水乙醇（Ⅰ）60 min、无水乙醇（Ⅱ）60 min、二甲苯（Ⅰ）45 min、二甲苯（Ⅱ）45 min。另一份按照改良流程处理：标本置于 75% 乙醇 60 min、85% 乙醇 60 min、95% 乙醇（Ⅰ）120 min、95% 乙醇（Ⅱ）120 min、无水乙醇 60 min、无水乙醇+二甲苯（1∶1）60 min、无水乙醇+二甲苯（1∶1）45 min、二甲苯45 min。对2种流程处理的组织进行石蜡包埋，常规切片，以脂肪组织切片的完整与破损作为评分标准，进行切片质量比较。实验4：对传统及改良流程中95%乙醇、无水乙醇、无水乙醇+二甲苯（1∶1）的沉淀物进行油红O脂肪染色。实验 5：不同处理下日常切片质量评分，2017 年 7 月共16 549块组织采用传统方法处理，2017年8月共15 465块组织采用改良方法处理，评分标准采用等级医院检查标准。

实验6：对改良流程中95%乙醇、无水乙醇、无水乙醇+二甲苯（1∶1）试剂内的沉淀物进行微谱分析。

二、结果

1. 猪油倒入二甲苯10 s内就被彻底溶解，倒入95%乙醇的猪油浸泡48 h后无明显变化（图1）；倒入无水乙醇的猪油浸泡48 h后外表略干燥，并出现少量细小的颗粒悬浮在试剂里（图2）。

2. 固定充分的富含脂肪人肠及系膜组织分别放入75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯、无水乙醇+二甲苯（1∶1）混合液24 h后，肉眼可见组织在75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇无明显变化；倒入二甲苯的组织，组织里的水将二甲苯隔离开来，产生乳白色的油水隔离膜；而放入无水乙醇+二甲苯（1∶1）混合液的组织呈透明状（图3）。

3. 286块带脂肪的人体组织：其中胃肠组织206块、乳腺组织80块，传统与改良流程处理的切片完整率分别为41.26%（118/286）和92.31%（264/286）。采用传统及改良流程连续处理 1 个月的日常切片优片率分别为 98.08%（16 232/16 549）和99.42%（15 376/15 465），改良流程处理的组织蜡块比传统流程处的组织蜡块明显好切，且切片平整，容易连片，蜡块不内陷。

4.沉淀物的油红O脂肪染色：传统流程85%乙醇、95%乙醇第Ⅰ道表面有油滴浮在上面，而沉淀为少量的白色颗粒（油红O不着色）、95%乙醇第Ⅱ道白色粗颗粒沉淀（油红O着色）、无水乙醇第Ⅰ道白色细颗粒（油红O着色）、无水乙醇第Ⅱ道白色细颗粒沉淀（油红O着色）。改良流程无水乙醇以前（包含无水乙醇）的结果和传统流程相同，但无水乙醇+二甲苯第Ⅰ道和第Ⅱ道刚开始使用时，肉眼无沉淀物产生（离心后液体有少量油红O着色），处理到1 800块左右组织后，黄色细颗粒状沉淀开始出现（油红O着色），而且增加速度明显，明显多于无水乙醇产生的沉淀；到3 000块左右组织时，无水乙醇+二甲苯第Ⅱ道也开始出现大量沉淀（油红O着色；图4，5）。

5.微谱检测结果：沉淀物均为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。

三、讨论

组织前处理中固定、脱水、脱脂都是比较重要的环节，脱水过程中组织样本应充分的脱水和脱脂，否则石蜡不能渗入组织从而起到很好的支撑作用，技术人员无法切出完整的切片。切片后的蜡块与空气接触，组织内的水分挥发而产生凹陷、干涸，不利于后继检测以及蜡块的长期保存。乙醇是一种很好的固定剂和脱水剂，利用相似相溶原理将组织内的水分置换出来。组织经充分固定后，乙醇在组织处理环节主要起到的是脱水作用，而二甲苯起到透明作用［1］ ，我们一直认为乙醇在组织处理过程中还起到脱脂的作用［2］ ，然而我们通过观察提炼动物脂肪（猪油）在乙醇和二甲苯内的表现，发现真正起到溶解脂肪的试剂是二甲苯。二甲苯是由45%～70%的间二甲苯、15%～25%的对二甲苯和10%～15%邻二甲苯3种异构体组成的混合物。能与无水乙醇、乙醚和其他许多有机溶剂混溶，是非极性溶剂。脂肪不溶于水，易溶于乙醚、氯仿、苯等非极性溶剂中，与我们的实验结果相符。

在组织处理过程中，乙醇通过渗透逐步脱去取材组织内的水，当乙醇浓度低时，液体含水量高，组织表面的脂肪被洗涤浮在液体的表面，当组织进入高浓度乙醇（95%以上）后，通过乳化作用，将组织内少量脂肪酸置换出组织，悬浮在脱水试剂里，这些颗粒静止时就沉淀下来，随着乙醇浓度增加和脱水时间的延长，颗粒干燥、脆裂、变小，当组织进入二甲苯后，脱水干净的脂肪被溶解成肉眼看不见的细小颗粒弥散在二甲苯里。我们把95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、无水乙醇、无水乙醇+二甲苯悬浮液进行离心，对离心后的沉

淀物分别进行油红O染色，结果95%乙醇Ⅱ、无水乙醇、无水乙醇+二甲苯沉淀物为阳性，表明其成分均为脂肪，沉淀物的微谱检测结果也证实了这一点。如果组织内含有水，我们通过实验2发现这类组织即使长时间浸在二甲苯里，二甲苯也不能渗透到组织里，更无法将脂肪溶解。这就解释了在日常工作中，由于乙醇在油脂中比在其他组织中的渗透速度要慢得多［3⁃4］ ，在组织脱水时间有限（需要在规定的时间内完成）的情况下，往往会导致较厚或含脂肪的组织脱水不彻底（图6），组织内残留的水分阻碍了二甲苯有效地渗透到组织内溶脂或替代乙醇的作用，造成组织浸蜡不充分，难以切片。

周剑莉等［5］ 提出，在二甲苯透明前使用乙醇与二甲苯液处理30 min可以使脱水变得彻底。当使用了无水乙醇和二甲苯混合液后，二甲苯可以将脱水干净的外表脂肪迅速溶解（图7），从而促进无水乙醇的渗透，无水乙醇与二甲苯协同交替作用，达到一边脱水一边溶脂的功效，使脂肪或有脂肪包裹的组织得到充分的脱水与透明，保证石蜡有效的浸透，切片的完整性明显提高。在286块脂肪组织切片中，完整性从41.26%提高到92.31%，当然，过厚或固定不充分的脂肪组织也无法得到完美地处理，约占7.69%。另外，对

于不含脂肪的取材组织，由于改良流程脱水、透明充分，虽然切片质量在镜下无明显差异，但在切片过程中薄、平整、更容易切（图8~10）。在日常工作评分标准中，周围脂肪的切片不全对切片优片率的评分影响不大，但总体切片的优片率还是从98.08%上升到99.42%。由于组织脱水充分，即使长时间浸泡在二甲苯中，也不会出现组织发硬、发脆的现象［6］ 。因此，我们认为将分别使用乙醇、二甲苯液的传统流程改为以等量混合使用乙醇⁃二甲苯液进行脱水的流程更科学，适用于日常工作中组织样本的常规处理。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

志谢 首都医科大学附属北京安贞医院病理科王伟老师给予实验指导

作者贡献声明 丁伟、周立新：实验设计、论文撰写；唐巍、张淼、唐蒙蒙、张晟：实验操作；应李雄、姚洪田：数据整理及分析

参 考 文 献

[1] 王泊沄,李玉松,黄高昇,等.病理学技术[M].北京:人民卫生出版社,2000.

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（收稿日期：2018⁃08⁃20）

（本文编辑：倪婧 王世贤）