来源：临床与病理杂志

作者：刘镜文，和月生，胡慧珍，刘文科，吴彬，吴秋良

【摘要】

目的：评价P16INK4a与Ki67两个辅助指标对提高基层病理医师在宫颈上皮病变诊断准确性中的作用。

方法：选取207个宫颈活检病例行HE染色及P16INK4a，Ki67免疫组织化学染色，分2次邀请5名县市级医院病理医师进行诊断。 第一次每位病理医师只阅读常规HE染色切片进行诊断，对比5名病理医师之间诊断的一致性；半年后再次邀请这5名病理医师结合P16INK4a，Ki67免疫组织化学切片进行诊断，对比病理医师之间诊断的一致性，并计算前后2次阅片Kappa值及符合率，最后对比5名病理医师的诊断与参考标准之间的一致性及符合率，分析其统计学意义。

结果：单独依靠常规HE切片进行诊断时，病理医师之间的诊断一致性及病理医师与“参考标准”之间的诊断一致性为弱至中度(Kappa值分别为0.344±0.072，0.385±0.053)，符合率较低(55%~70%，60%~65%)。但联合P16INK4a及Ki67结果进行诊断，病理医师之间的诊断一致性及病理医师与“参考标准”之间的诊断的一致性可达到高度或极强(Kappa值分别为0.700±0.051，0.792±0.043)，符合率分别提高到78%~88%与85%~91%，两组指标差异均有统计学意义(P<0.05)。

结论：联合应用P16INK4a及Ki67免疫组织化学检测结果，可明显提高临床上宫颈活检病变诊断的准确性。宫颈癌严重危害女性身体健康，在宫颈癌筛查中，宫颈活检组织病理诊断直接指导细胞学筛查结果异常的女性的后续管理。低级别鳞状上皮病变 (low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL；CIN I)以下患者进行定期复查，而高级别鳞状上皮病变(high grade squamous intraepithelial lesion，HSIL；≥CIN II)以上患者需要进行宫颈锥切。组织学假阳性的结果会导致患者的过度治疗，而组织学假阴性的结果也会延误患者的治疗，因此准确识别宫颈病变的组织学本质有至关重要的意义。

然而国外多个研究 [1-2]表明：在只有宫颈活检组织常规HE切片的情况下，不同病理医师对宫颈病变的诊断有着很大的差异，其重复性为低至中度(Kappa：0.2~0.5)。临床上诊断困难的病例往往会让多个病理医师共同讨论得出一致的意见。 但县市级等基层医院缺乏病理医师，往往只有1~2 名，因此迫切需要客观、可靠的指标来协助病理医师进行精确诊断。

研究[3-4]表明：P16INK4a及Ki67的强表达与HSIL关系密切 。本研究拟探讨 P16INK4a及 Ki67对提高基层病理医师在宫颈上皮病变诊断准确性的作用。

1.材料与方法

1.1 材料

收集惠州市妇幼保健计划生育服务中心2016年3月至2017年2月宫颈活检病例，所有活检组织经过中性甲醛固定，在ASP200脱水机 ( 德国 Leica 公司 ) 里进行脱水、透明、浸蜡处理，石蜡包埋，切成3μm厚的常规石蜡HE及免疫组织化学切片。纳入标准：1)采用阴道镜下宫颈活检标本；2)均由中性甲醛及时充分固定； 3)不包括浸润性鳞癌及腺上皮病变；4)不合并其他肿瘤 。排除标准：1)活检组织病灶太小，不能重新连续切片的病例；2 ) 活检组织中无鳞状上皮的病例；3)活检组织常规HE切片经过2名市级以上三甲医院高级职称 ( 副主任医师以上 ) 的病理医师应用双人共揽显微镜一起阅片不能形成统一意见的病例。经过筛选最终选取病例 207例，其中正常114例，LSIL37例，HSIL56例 。本研究经惠州市妇幼保健计划生育服务中心伦理委员会审核批准。

1.2 方法

对选取的207个病例进行连续切片，行常规HE染色及P16INK4a，Ki67免疫组织化学染色，分2次邀请5名县市级医院病理医师阅片并按照TBS诊断系统进行诊断，将诊断分为3类：1)正常；2)LSIL；3)HSIL。第1次阅片时，每位病理医师只阅读常规HE染色切片进行诊断、记录及统计结果，计算5名病理医师之间诊断的可一致性(用Kappa值表示)及符合率；半年后再次邀请这5名病理医师阅读常规HE切片及P16INK4a，Ki67免疫组织化学切片进行诊断、记录及统计结果，再次对比5名病理医师之间诊断的一致性及符合率。最后计算5名病理医师的诊断与参考标准之间的一致性及符合率，分析其统计学意义。

1.2.1 P16INK4a及Ki67免疫组织化学染色

P16INK4a及Ki67抗体均购自福州迈新公司 。将P16INK4a ( 克隆号：6H12 ) 及Ki67 ( 克隆号：MIB1) 置于Bond-MAX免疫组织化学仪(德国 Leica公司 )上染色 。抗原修复液选择ER2，DAB显色，苏木精复染，每批免疫组织化学染色均设置阳性对照及阴性对照。

P16INK4a免疫组织化学结果判读：阳性(病变上皮大于中下1/2范围弥漫连续棕黄色表达)，表达部位为胞浆及细胞核 。Ki67免疫组织化学结果判读：阳性(病变上皮中表层弥漫棕黄色表达)，表达部位细胞核。

1.2.2  参考标准

参考标准为2名市级以上三甲医院高级职称(副主任医师以上)的病理医师应用双人共揽显微镜一起阅片得到一致性的诊断。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0 软件对所得数据进行统计分析。Kappa检验是分析诊断一致性的主要方法，参考Malpica等 [5]对Kappa值的解释，计算Kappa值，Kappa值的大小分为4个级别：弱(Kappa≤0.4)、中度(0.4

2.结果 

2.1病理医师之间诊断一致性的比较 

在只有宫颈活检组织常规HE切片的情况下，不同病理医师之间对宫颈病变的诊断有很大的差异(Kappa值：0. 259~0.480，0.344 ± 0.072)，一致性为弱至中等，符合率较低( 55%~70% )。半年后进行第 2 次阅片，在常规HE切片的基础上增加P16及Ki67免疫组织化学染色进行辅助诊断，病理医师之间诊断的一致性均明显提高(Kappa值：0.651~0.804，0.700±0.051)，差异有统计学意义 ( P<0.05 ) ；且符合率也有明显提高(78%~88%)，两两相比，差异均有统计学意义(均P<0.05；表1)。

2.2 病理医师诊断与参考标准一致性的比较

在只有宫颈活检组织常规HE切片的情况下，每位病理医师的诊断与参考标准之间有很大的差异(Kappa值：0.325~0.458，0.385±0.053)，一致性为弱至中等，符合率较低(60%~65%)。增加P16及Ki67免疫组织化学染色进行辅助诊断，病理医师诊断与参考标准之间的一致性均明显提高 (Kappa值：0.739~0.853， 0.792±0.043)，与之前数据比较，差异有统计学意义(P<0.05)；同时符合率也明显提高(85%~91%)，两两相比，差异均有统计学意义(均P<0.05；表2)。

2.3 典型病例

图1所示病例左侧为正常鳞状上皮，右侧为HSIL。在只阅读 HE切片的情况下， 5名病理医师中只有1名诊断为 HSIL，但在同时阅读 HE切片、P16及 Ki67免疫组织化学切片的情况下，5名病理医师均能正确诊断为HSIL。

3.讨论

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率在女性恶性肿瘤中居第2位，仅次于乳腺癌 [6]。在宫颈癌防治过程中宫颈活检病理诊断起重要作用，精确的活检结果可正确指导临床进一步诊疗方案制定，而病理结果作为最后诊断被称为 “金标准”，但其准确性却少有人关注。近几年国外相关研究 [ 7-8 ] 表明 ：病理医师单独依靠常规HE切片进行诊断时，可重复性只有中度，但联合P16INK4a及Ki67免疫组织化学结果进行诊断，诊断的一致性可达到高度或者极强。宋建明等 [ 9 ] 对宫颈非典型性不成熟化生及其类似病变诊断的一致性进行探讨，发现不同评估者对不成熟化生和CIN III 的诊断具有较高的一致性，而对非典型性不成熟化生、湿疣、CIN I 和CIN II 的诊断一致性均较差，但该研究未提及相应的解决方案。由于我国医疗体系建制的问题，基层医院病理科技术力量十分薄弱，多数县市级医院病理科只有1 ~2名病理医师，病理诊断的准确性得不到保障。 因此迫切需要了解基层医院病理医师对宫颈病变诊断的一致性，寻找合适客观的指标辅助诊断，以提高基层医院病理医师对宫颈病变诊断的准确性。

P16INK4a 是一种细胞周期依赖激酶抑制因子，其过表达与高危型人乳头状瘤病毒 ( human papillomavirus，HPV ) 感染密切相关 。癌基因蛋白E7灭活细 胞周期调控Rb蛋白，导致P16INK4a过表达 。 研究 [ 10-11 ] 表明：P16 的过表达与 HSIL( ≥CIN II) 关系密切，是较为理想的预后观察指标。Ki67表达于除 G0期外的细胞增殖周期，正常宫颈上皮 Ki67只表达于基底层及副基底层细胞，而在宫颈病变中Ki67可表现为全层鳞状上皮弥漫阳性表达[8]。但罕有研究报道这两个免疫组织化学指标的应用对于提高我国病理医师在宫颈病变诊断的一致性的意义。

综上所述，单独依靠常规HE切片进行诊断时病理医师之间的诊断一致性及病理医师与参考标准之间的诊断一致性为弱至中度，符合率低；但联合P16INK4a及Ki67免疫组织化学结果进行诊断，诊断的一致性能达到高度或者极强，符合率也大幅提高。因此联合应用 P16INK4a及Ki67免疫组织化学检测结果，病理医师可明显提高宫颈活检病变诊断的准确性，特别是在基层医院缺乏病理科人才的情况下，这两个指标能很好地辅助病理医师对宫颈病变做出准确诊断，提高病理结果的可靠性。

参考文献 

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