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抗体验证——Ki67

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[导读] 来源:信纳克流式服务

上一篇文章给大家介绍了 TdT 抗体如何选择,接下来我们再聊一聊 Ki-67, 同样也是一个核膜抗体。

抗体验证——Ki67

Ki67名字的由来

Ki-67蛋白最初是由原型单克隆抗体Ki-67定义的,该抗体是通过用霍奇金淋巴瘤细胞系L428的细胞核免疫小鼠而产生的。该名称来源于德国城市 Kiel(Ki)和原无性系96孔板的编号67。Ki67 的名字一直被保留了下来。

Ki67介绍

抗原KI-67也称为Ki-67或MKI67,是一种在人类中由MKI67 基因(由单克隆抗体Ki-67识别的抗原)编码的蛋白质。 Ki-67蛋白存在于细胞周期的所有活跃阶段(G 1,S,G 2和有丝分裂),但在静息细胞(G 0)中不存在。所以Ki67蛋白的表达与恶性肿瘤固有细胞群体的增殖活性相关联,被用作肿瘤侵袭性的标志物。

Ki67 功能

1.   Ki67被广泛用于评估肿瘤的增殖率,在非造血系统恶性肿瘤中,增殖率具有诊断和预后的价值。在血液病学中Ki67指数主要用于评估分级,尤其是用于评价淋巴瘤的侵袭性。

2.   Ki67 预后判断指标,利妥昔单抗药物治疗后评估预后。

3.   Ki67 作为癌症治疗的潜在靶点。

4.  关于ki67在不同技术中使用的阳性阈值:因为技术手段和室间差异以及背景评价问题,长期以来存在一定的争议,大多数采用的是:病理学组化方法,使用的标准是30-40%为阴性阳性界限;流式细胞术胞浆处理方法一般使用20%为界。

5.  ki67在成熟B细胞淋巴瘤中的辅助诊断意义:在CD10+成熟B细胞淋巴瘤的鉴别诊断中尤其重要。burkitt是FSC中等大小肿瘤,ki67高表达,病理学几乎100%阳性,流式典型病例80-90%以上,但是少数FISH为轻链与cmyc重排的burkitt,ki67可以部分表达。DLBCL是FSC中等偏大细胞,一般部分表达ki67(20-80%)。其中类burkitt型DLBCL(mimic burkitt),可以达到80-95%;但是也有的cmyc高表达的病例具有DLBCL形态,ki67低于30%,所以认为DLBCL中,ki67仅供参考,不能用来选择作为是否进行cmyc检测的指标。滤泡淋巴瘤是典型小细胞,ki67阴性,除非高恶性度向DLBCL转化的滤泡淋巴瘤,会出现部分表达ki67。

Ki67 试剂的选择和实验操作

在抗体的选择上,目前信纳克实验室使用的是

BD Pharmingen FITC MouseAnti-Ki-67 Set(clone:B56)

破膜试剂的选择(BD IntraSure Kit)

实验操作方法:

1.   样本用含有1%BSA的PBS洗涤三次;

2.   细胞膜进行染色,加入适量的抗体和样本,室温避光 15min;

3.   加入BD IntraSure Kit 破膜剂A液 100ul,避光孵育 5min;

4.   加入BD 溶血素(1X)2ml,裂解红细胞 10min;

5.   离心 300g/5min,弃掉上清,悬浮细胞,加入B液50ul,同时加入 ki67-FITC 20ul,涡旋混匀,室温避光孵育15min;

6.   洗涤,加入2ml PBS 涡旋混匀,300g/5min;

7.   补充300ul含有1%的多聚甲醛 PBS,上机检测。

结果解读:

由于破膜剂会造成细胞物理性质的变化,样本处理后引起非特异染色,从而给结果阴阳性的判断带来一定难度。

在骨髓样本中,判断结果要合理利用好内对照和圈门判读结果。

阳性内对照:有核红细胞及B系祖细胞,所以首次购买抗体以及重复验证抗体时,建议选择有核红细胞和增生B祖细胞较多的标本,使用CD45/ki67组合,以及B细胞门内的ki67/CD79b组合或者ki67/CD10组合进行评价,见图1。

阴性内对照:与目的细胞大小、颗粒性相近的粒细胞、单核细胞或者成熟淋巴细胞。

正常骨髓样本中Ki67表达情况如下图所示(见图1)

图1:

抗体验证——Ki67

在CD45/Ki67散点图可见,有核红细胞表达Ki67。CD19/SSC散点图中,圈出CD19+B细胞,可见原幼阶段的CD19+B细胞,表达CD10阳性,CD79b阴性,CD20阴性,部分增殖活跃的细胞表达胞浆Ki67。

在成熟阶段B细胞,表达CD79b阳性,CD20阳性,CD10阴性,胞浆Ki67阴性。故不存在CD79b阳性、CD10阳性,Ki67阳性的细胞,可作为CD10+B淋巴瘤(尤其在Burkitt淋巴瘤、DLBCL淋巴瘤)的鉴别点。另外在T细胞淋巴瘤细胞及NK细胞淋巴瘤细胞表达及部分表达也可以作为恶性细胞具有侵袭性的标志之一。

需要注意的是:

①   B-ALL的ki67表达存在异质性,所以不建议使用B-ALL标本评价ki67染色质量;

②   ki67本身只是一个增殖活性标志,并不是恶性标志。在NK/T淋巴瘤的时候,需要评价背景细胞(正常和反应性淋巴细胞)表达情况,只有背景淋巴细胞阴性,目的细胞阳性,才有意义,如果背景细胞也有ki67表达,则该肿瘤细胞的ki67意义有限。

示例一:部分表达ki67的B细胞淋巴瘤(见图2)

图2:

抗体验证——Ki67

示例二:(见图3)

Ki67的表达在 Burkitt淋巴瘤,合理运用圈门对肿瘤细胞群进行分析。

图3(P3门红色箭头所示):

抗体验证——Ki67

示例三:以有核红细胞作为阳性内对照(见图4)

NK细胞淋巴瘤(胞浆Ki67在NK淋巴瘤细胞的表达率为38.99%。)

图4:

抗体验证——Ki67

示例四:以淋巴细胞作为阴性内对照(见图5):

图5为T淋巴瘤病例,参考正常淋巴细胞阴性设门,参考有核红细胞阳性设门,即CD7阴性,CD3阳性的T细胞淋巴瘤细胞的胞浆Ki67表达率为40.45%。因T淋巴瘤细胞部分表达胞浆Ki67,考虑具有侵袭性。

图5:

抗体验证——Ki67

总结:

Ki67作为肿瘤侵袭性的标志物,在疾病的诊断和预后评估广泛应用。

试剂的选择和结果判断也非常重要。信纳克实验室列举了Ki67 的试剂操作方法和结果判读过程中如何合理使用内对照。

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抗体验证——Ki67


参考文献:

1.Gerdes J, Schwab U, Lemke H,Stein H: Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a humannuclear antigen associated

with cell proliferation. Int J Cancer 31:13–20, 1983.

2.Bryant R J, Banks PM & O’Malley D P. Ki67 staining pattern as a diagnostic tool in theevaluation of lymphoproliferative disorders.(2006) Histopathology 48, 505–515

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