1.前言

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一种易转移的恶性肿瘤，与EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）密切相关。尽管EB病毒在世界范围内普遍存在，但NPC的发病率只在某些民族和流行地区占主导地位。EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是人类疱疹病毒4型（human herpesvirus 4），属于疱疹病毒科（Herpesviridae）的γ疱疹病毒亚科（Gammaherpesvirinae）的淋巴细胞病毒属（Lymphocytovirus）。它在20世纪60年代首次在伯基特淋巴瘤细胞中发现。该病毒被归类为I组致癌物，与所有人类恶性肿瘤的1.5%和所有癌症相关死亡的1.8%有关，包括伯基特淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，B细胞、T细胞和NK细胞淋巴瘤，胃癌和鼻咽癌。鼻咽癌（NPC）和胃癌占EBV引起的恶性肿瘤的82%，占EBV相关肿瘤死亡的89%。已知EBV在超过90%的全球人群中无症状地引起终身持续感染。尽管如此，全球只有一小部分人患有NPC，其发病率特别显示出对某些人群和地理区域的显著偏好。在NPC流行区，EBV导致95%的NPC发病率和100%的NPC相关死亡率。相比之下，在低发病率地区，20%的NPC发病率和80%的NPC死亡率归因于EBV。此外，鼻咽癌在男性中占主导地位，男性的鼻咽癌发病率比女性高出2-3倍。NPC病例的独特分布暗示了多种因素的作用，包括宿主遗传学和环境因素与病毒因子在鼻咽癌发生中的相互作用。

NPC在组织学上分为角化性鳞状细胞癌（1型）、非角化性鳞状细胞癌（2型）和未分化癌（3型）。EBV在2型和3型NPC中的流行率为100%，其在流行地区占优势。目前，国际癌症控制联盟或美国癌症联合委员会（UICC/AJCC）分期系统用于NPC患者的治疗指导和预后预测。单独采用放疗或联合化疗治疗鼻咽癌取得了良好的临床效果，在过去十年中，早期患者的5年总生存率（OS）高达94%，而晚期（III期和IV期）NPC患者的5年OS率（73.7%）急剧下降。然而，由于NPC的非特异性症状，包括头痛，鼻出血和面部疼痛，NPC的早期检测仍然是一个重大挑战。此外，5 - 30%的NPC患者治疗后可发生局部或远处复发。因此，需要具有高准确性、精确性、敏感性和特异性的诊断性、预测性和预后性生物标志物来早期诊断NPC和预测NPC患者的治疗反应。针对鼻咽癌特异性分子靶点的有效治疗策略可以改善鼻咽癌患者的临床预后。本文就EB病毒在鼻咽癌中的致癌作用及其临床应用作一综述。

2.EBV在鼻咽癌发病中的作用

非角化性鳞状细胞癌在鼻咽癌流行区占绝大多数，与EBV感染密切相关。其中东亚和东南亚占NPC全球发病率的70%以上，其次是中南亚（6.3%），北非（2.6%）和南非。该疾病表现出对某些种族群体的偏好，包括居住在中国南方的广东人、婆罗洲的必达优人和居住在北极的因纽特人。这种独特的流行病学模式表明，NPC的发病是一个多步骤的过程，涉及EBV、宿主遗传易感性和环境因素（包括吸烟、饮食成分和职业暴露）之间的相互作用。几十年来，先进技术的实施有助于更深入地了解基因组和表观基因组景观，肿瘤微环境以及EBV在NPC中的致病作用。已经报道了几个与鼻咽癌易感性相关的候选基因，包括与免疫反应相关的基因。位于染色体6p21上的主要组织相容性复合体（MHC）区域的人白细胞抗原（HLA）复合体的遗传多态性可能由于EBV抗原呈递至细胞毒性细胞受损而赋予对NPC的易感性，因此有助于EBV相关NPC的种族易感性。此外，鉴于男性在鼻咽癌发病率中占主导地位，X染色体连锁多态性的参与影响先天免疫反应，可以提高对EBV感染的易感性。一个可能的候选者是编码Toll样受体8（TLR 8）的基因，其在东亚人中显示出特异性多态性。下一代测序技术指导的单核苷酸多态性（SNP）分析揭示了IL-10和SPLUNC 1的SNP与对NPC的易感性增加之间的关联。此外，多重家族的全外显子组测序报告了可能参与EBV病毒感染的基因变体，例如，编码整合素αvβ6 ITGB 6的基因，其促进EBV融合至上皮细胞；编码潜伏膜蛋白（LMP）相互作用蛋白的BCL 2L 12和NEDD 4L也与家族性NPC相关。

暴露于致癌物如来自酒精的乙醛和来自吸烟的多环芳烃诱导DNA聚合物的形成，导致DNA修复受损和活性氧物质的产生，其随后诱导鼻咽上皮的遗传改变，并导致有利于EBV感染和持久性的低度发育不良病变的形成。尤其，关于在具有发展NPC的高风险的个体的正常鼻咽上皮中和在低度发育不良病变中染色体3 p和9 p上的杂合性频繁丢失的报道表明，遗传事件发生在NPC的早期发病过程中并且可能在EBV感染之前。染色体9 p上的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（CDKN 2A）的缺失导致细胞周期蛋白D1（CCND 1）的表达增加，并通过抑制EBV诱导的生长停滞和衰老而导致持续的潜伏性EBV感染。另一方面，环境因素，特别是吸烟，与EBV再活化有关，EBV再活化产生感染性产物并调节参与致癌作用的信号级联，从而导致NPC。香烟烟雾提取物体外促进EBV复制并诱导裂解基因表达。流行病学研究揭示了吸烟与EBV的持续再活化的关联，如其抗体的血浆水平升高这增加了致癌风险。

NPC中EBV感染的克隆起源暗示其参与NPC的早期形成。据推测，病毒诱导的上皮变化发生在生命早期的罗森米勒窝中存在的转化区，此时宿主免疫应答的调节依赖于TLR 8。因此，儿童早期的EBV感染可能使个体易患EBV相关的NPC。EBV进入鼻咽上皮细胞的确切机制仍不清楚。早期研究表明，EBV特异性多聚IgA可诱导EBV组织向性转移，促进其在上皮细胞中的感染。与IgA结合的EBV可以通过内吞作用进入上皮细胞，内吞作用是由分泌组分介导的过程，分泌组分是在上皮细胞的基底外侧表面上表达的跨膜蛋白。另一方面，如在体外和体内模型中所证实的，推测EBV感染主要通过细胞介导的感染在鼻咽上皮细胞中建立。研究还报道整合素αvβ5、αvβ6和αvβ8参与触发EBV糖蛋白介导的上皮细胞融合gHgL。此外，最近的研究揭示了促进EBV内化和与鼻咽上皮细胞融合的两种受体，包括神经纤毛蛋白1（NRP 1）和肝配蛋白受体酪氨酸激酶A2(EphA2)。NPC中的EBV感染通常以II型潜伏模式为代表，其中Epstein-Barr核抗原1（EBNA 1）、潜伏膜蛋白（LMP）1和2以及非编码RNA表达并诱导进一步的遗传和表观遗传变化，从而导致获得几种癌症标志。如Hanahan和温伯格所列举的，这些标志性能力包括[1]无限增殖潜力; [2]逃避生长抑制因子;[3] 抗凋亡; [4]永生复制; [5]血管生成; [6]侵袭和转移; [7]代谢重编程和[8]免疫破坏的消除。由体细胞突变或EBV潜伏基因表达诱导的多种信号传导途径的失调导致肿瘤微环境和免疫应答的调节。潜伏蛋白通过驱动EBV感染细胞的快速克隆扩增进一步促进肿瘤进展导致遗传和表观遗传事件的积累，导致NPC进展。

几项研究揭示了参与EBV裂解期的证据，其特征在于EBV裂解基因在三个阶段的表达，即超早期（IE），早期（E）和晚期（L）。在肿瘤发生中，IE基因，BZLF 1和BRLF 1，是激活E裂解基因的裂解级联的重要启动子，E裂解基因编码病毒复制所需的酶，如BALF 3。随后，表达L裂解基因并发生细胞裂解以释放病毒颗粒。血清学研究揭示了IE和E裂解基因与肿瘤进展和免疫细胞浸润之间的关联，表明在NPC患者中存在间歇性EBV流产再活化，其频率随着疾病进展而增加。裂解期通过产生将EBV感染传播至其他细胞的感染性病毒粒子并调节细胞致癌途径（包括免疫反应、血管生成、侵袭、细胞凋亡等）而促进肿瘤发生。

2.1.EBV引起鼻咽癌的遗传不稳定性

EBV通过参与DNA修复的基因失调诱导感染癌前细胞的遗传不稳定性; 细胞周期检查点; 抗癌活性。通过PI 3 K/Akt/FOXO 3a途径，EBV编码的LMP 1抑制DNA损伤结合蛋白1（DDB 1）介导的核苷酸切除修复。此外，LMP 1通过损害Chk 1活化诱导G2检查点缺陷，允许未修复的染色单体断裂进行有丝分裂，其进一步增殖和积累，导致染色体不稳定性。另一方面，EBV编码的miRNA，包括miR-BART 5 - 5 p、miR-BART 7 - 3 p、miR-BART 9 - 3 p、miR-BART 14 - 3 p，调节共济失调毛细血管扩张突变（ATM）基因的活性，其参与DNA双链断裂的修复。EBNA 1被证明可以促进携带DNA损伤的细胞的存活，从而促进NPC的发展。EBNA 1通过与细胞泛素特异性蛋白酶（USP）7或HAUSp相互作用破坏早幼粒细胞白血病核体（PML NB），干扰p53乙酰化、DNA修复和凋亡。EBV编码的裂解基因产物BALF 3可在宿主细胞中诱导染色体畸变和DNA链断裂。

EBV通过诱导NPC中DNA甲基化和组蛋白修饰等异常表观遗传学改变来调节基因表达，从而导致非突变性遗传不稳定性。在恶性组织的CpG岛（CGI）内或附近检测到高频率的超甲基化，在甲基化区域显著富集组蛋白二价标记。EBV潜伏蛋白，包括EBNA 1和LMP 1，可以与DNA甲基转移酶（DNMT）或脱甲基酶相互作用以调节表观遗传修饰。通过NF-κB信号传导，LMP 1通过激活DNMT 3 B诱导肿瘤抑制剂磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）的超甲基化和失活。DNA甲基化和组蛋白修饰联合诱导NPC表观遗传失调EBV感染通过异常组蛋白二价开关使DNA修复途径基因MLH 1失调。MLH 1下调与组蛋白H3赖氨酸4（H3 K4 me 3）的三甲基化减少和H3赖氨酸27三甲基化增强。

2.2.EBV参与肿瘤微环境的构建和免疫逃避

NPC的肿瘤微环境虽然抗肿瘤活性较有限但具有丰富的免疫细胞为特征。EBV有助于免疫细胞在NPC微环境中的积聚和NPC中的免疫抑制，从而促进肿瘤的发生、生长和发展。通过CTAR 1和2，LMP 1通过NF-κB和JNK信号级联诱导趋化因子的上调，包括募集巨噬细胞炎性蛋白（MIP）-1α和-1β的T淋巴细胞。EBV编码的RNA（EBER）通过TLR 3途径触发NPC中以TNF-α水平升高为特征的炎症反应。EBER还通过NF-κ B介导的正反馈环与LMP 1作用以放大NPC中的炎症反应。

EBV编码的潜伏蛋白和miRNA通过干扰细胞因子信号网络和抗原递呈促进免疫调节细胞在NPC免疫微环境中的浸润，诱导免疫细胞无反应性，从而损害宿主的免疫应答，促进病毒持续感染和肿瘤发生。EBV通过破坏趋化因子和细胞因子信号传导途径来调节先天性免疫应答。LMP 2A和2B通过加速干扰素（IFN）受体的内化来调节IFN活性。LMP 1和EBV裂解性反式激活因子BZLF 1/Zta诱导免疫抑制性细胞因子如白细胞介素（IL）-10的上调，其增强CD 4 + T辅助细胞中的调节功能并减少细胞毒性T细胞浸润。IL-10与Fas配体（FasL）表达正相关，其可能在抗肿瘤免疫细胞中引发Fas介导的细胞凋亡。EBV-miR-BART 6p靶向模式识别受体视黄酸诱导基因（RIG）-I mRNA以抑制EBV触发的IFN-β应答。EBV将调节性免疫细胞招募到NPC免疫微环境中，促进免疫逃避。EBNA 1促进了通过驱动C-C基序配体（CCL）20-和转化生长因子（TGF）-β-介导的调节性T淋巴细胞向肿瘤部位的浸润来积累免疫抑制性Foxp 3+调节性T淋巴细胞，并通过TGF-β的上调和M2巨噬细胞的极化来刺激幼稚T淋巴细胞转化为T淋巴细胞。代谢途径的改变导致骨髓源性抑制细胞（MDSC）在NPC微环境中扩增。EBV通过上调共刺激分子诱导免疫细胞耗竭。通过STAT 3、AP-1和NF-κB途径，LMP 1调节免疫检查点程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L1）促进免疫逃避。EBV-miR-BART 11和EBV-miR-BART 17 - 3 p分别通过抑制FOXP 1和PBRM 1来增强PD-L1转录。

EBV驱动NPC中的血管生成，这是将氧气和营养物质运输到恶性组织所必需的。EBV感染通过上调其调节因子基质相互作用分子1诱导钙池操纵的Ca 2+进入（SOCE）介导的血管生成。EBV感染的细胞通过PI 3 K/AKT和HIF-1α途径诱导趋化因子CCL 5介导的肿瘤血管生成。EBNA 1对转录因子激活蛋白（AP）-1的增强表达提高了血管生成细胞因子IL-8和血管内皮生长因子（VEGF）的表达，导致NPC中的血管生成。外泌体包装的EBER上调血管细胞粘附分子1（VCAM 1）的表达以促进血管生成，该过程涉及TLR 3和RIG-1。EBV-miR-BART 1 - 5 p通过调节AMPK/mTOR/HIF-1途径诱导血管生成。除了经典的血管生成外，EBV还诱导血管生成拟态，这是恶性细胞形成独立于内皮细胞的血管样结构的过程。通过LMP 2A激活PI 3 K/AKT/mTOR/HIF-1α信号级联促进NPC中的血管生成拟态。另一方面，LMP 1通过VEGF/VEGFR 1信号传导诱导血管生成拟态的形成。

2.3.EBV促进转移和侵袭

转移是涉及一系列事件的复杂过程，包括[1]肿瘤细胞侵入邻近组织，[2]内渗进入循环系统，[3]在外周血液循环中存活，[4]外渗进入远端组织和[5]定殖。上皮细胞经历上皮间质转化（EMT）以增强其运动性和侵袭性，结果以上皮标志物如E-钙粘蛋白的减少和间质标志物包括波形蛋白的增加以及形态学改变为梭形形状为标志。研究显示，在NPC肿瘤的侵袭性前沿，具有梭形形态的细胞和与癌症干细胞和EMT相关的分子标志物的表达显著，这些特征与EBER和LMP 1高度相关。还报道了LMP 2A与侧群干细胞样癌细胞相关，但与形态学变化无关。LMP 1通过调节转录因子（包括Snail和Twist）来促进EMT。LMP 1增加钙网蛋白的表达，通过TGF-β/Smad-3/NRP 1轴促进EMT。通过mTOR通路，LMP 2A诱导转移性肿瘤抗原1（MTA 1）的过表达，以促进NPC肿瘤细胞的上皮间质转化。通过介导TGF-β1/锌指E盒结合同源异型盒（ZEB）/ miR-200反馈环，EBNA 1诱导NPC中的EMT。EBV-miR-BART 7 - 3 p、BART 8 - 3 p、BART 10 - 3 p、BART 13 - 3 p和BART 22分别通过靶向NPC细胞中的PTEN、RNF 38、BTRC、ABI 2和MOSPD 2基因诱导EMT过程。

EBV靶向细胞粘附分子，包括钙粘蛋白和整合素，以诱导宿主恶性细胞的间充质样表型。LMP 1通过诱导其基因启动子CDH 1的超甲基化来下调E-钙粘蛋白的表达。EBV编码的miRNA-BART 9增强对E-钙粘蛋白的抑制作用，促进NPC细胞的侵袭性。LMP 2A通过调节整合素β4（ITGβ4）亚基在细胞突起的定位来促进NPC细胞的运动。LMP 2A竞争性结合脾酪氨酸激酶（Syk），后者负责ITGβ4亚基的内化和细胞迁移的抑制。此外，LMP 2A通过EGFR/Ca 2 + / calpain/ ITGβ4途径加速ITGβ4的切割。

研究揭示了EBV利用的其他转移机制，包括基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，其降解基底膜并允许NPC细胞的侵袭。LMP 1通过CTAR-1和CTAR-2与肿瘤坏死因子受体家族相关因子（TRAFs）相互作用，促进MMP-9启动子的激活。它通过NF-κB和AP-1转录因子的活化进一步诱导MMP-9酶活性。LMP 2A通过ERK 1/2-Fra-1轴并通过其PY基序触发MMP 9的表达。BRLF 1/Rta通过MMP-9的旁分泌促进NPC的侵袭性。除此之外，LMP 1上调神经营养酪氨酸激酶受体2（NTRK 2或TrkB）表达，以通过NF-κB信号传导增强NPC细胞的抗失巢凋亡，这是从肿瘤脱离后存活所必需的。

2.4.EBV促进NPC的代谢重编程

瓦尔堡效应或有氧糖酵解常见在恶性细胞。EBV通过线粒体功能的改变调节NPC细胞中的代谢开关，有助于糖酵解升高、增殖增强和凋亡抗性。LMP 1通过上调DNMT 1的表达和活性来下调PTEN/AKT信号传导，从而激活糖酵解通量。此外，LMP 1促进DNMT 1的线粒体易位，从而诱导线粒体DNA D-环区的超甲基化和氧化磷酸化（OXPHOS）复合物的下调，引起NPC中的代谢重编程。EBV通过多种信号通路参与葡萄糖代谢的调节。通过AKT/ERK/IKK信号传导，LMP 1诱导mTORC 1活化，其随后诱导NF-κB信号传导并增强葡萄糖转运蛋白（GLUT）1的转录，从而增加NPC细胞中的葡萄糖摄取。此外，LMP 1诱导成纤维细胞生长因子受体（FGFR）1的表达并激活其信号传导，从而通过糖酵解途径相关蛋白的磷酸化促进有氧糖酵解如乳酸脱氢酶。BART 1 - 5 p激活AMPK/mTOR/HIF 1通路，促进转化为有氧糖酵解。EBV通过调节HIF-1α、c-Myc和HoxC 8等多种转录因子改变NPC的糖代谢。LMP 1通过减弱PI 3 K/Akt-GSK 3 β-FBW 7信号传导轴（介导c-Myc的泛素化依赖性降解）延长c-Myc（能量代谢的主要调节因子）的半衰期。C-Myc随后参与LMP 1介导的己糖激酶（HK）2的上调，己糖激酶（HK）2是糖酵解的关键参与者。通过停止RNA聚合酶II，LMP 1抑制同源框（Hox）基因，包括糖酵解调节因子HoxC 8。葡萄糖代谢的改变通过促进EBV介导的感染细胞永生化、持续的EBV潜伏期、抗凋亡和调节宿主免疫应答而促进肿瘤发生。

除了糖酵解通量，脂质和氨基酸的代谢变化在NPC中有报道。LMP 2A下调脂肪甘油三酯脂肪酶，抑制脂质过氧化反应，这导致NPC细胞中脂滴的积累，从而增强它们的迁移能力。血浆脂质组学揭示了血浆脂质谱与反映EBV溶解-潜伏周期的EBV抗体滴度以及与疾病进展的相关性。因此，提示EBV通过调节脂质代谢潜在地影响NPC的预后。此外，表达LMP 1的NPC细胞显示出谷氨酰胺的消耗增加。

NPC独特的地理和种族优势突出了EBV、遗传易感性和环境因素之间的相互作用在NPC的发生和发展中的重要性。多“组学”技术的进步为理解NPC癌变过程中复杂的相互作用提供了线索。化学致癌物诱导的遗传畸变和遗传易感性可能增强个体对EBV感染的易感性，同时促进潜伏期的建立并导致宿主细胞的恶性改变。进一步阐明EBV在NPC中的确切致病作用将有助于发现有用的生物标志物和治疗靶点。开发更有效的体外系统，用于调查上皮细胞中的EBV生命周期，将使更全面的研究病毒-宿主相互作用在鼻咽癌的肿瘤发生。未来的研究需要确定已鉴定的基因对NPC的遗传易感性及其与病毒因子的相互作用的生物学作用。建议增加样本量以获得具有更高可靠性和可重复性的结果，从而允许对NPC的个体风险进行分层，并在高危人群中开发具有成本效益的NPC筛查策略。此外，由于环境因素与鼻咽癌的发展有关，我们建议针对高危社区制定生活方式改变计划或指引，以减低他们患鼻咽癌的风险。EBV和NPC之间的密切联系促使开发针对EBV的预防性疫苗，并验证其在预防NPC，特别是在流行地区的长期有效性。

3.EBV亚型

尽管EBV感染广泛，影响全球90%的成年人，但EBV相关的NPC显示出倾斜性地理分布，提示EBV序列变异在NPC发病中的作用。这刺激了对各种EBV亚型的地理和种族相关性及其在特定EBV相关肿瘤发展中的作用的研究。EBNA 2和3s基因序列的等位基因的主要变异将EBV聚集成1型和2型毒株。1型EB病毒，包括B95.8、Akata、Mutu、C666-1、M81、GD 1和GD 2，显示全球流行，通常与NPC相关。另一方面，2型EBV如AG 876、Jijoye和Wewak在巴布亚新几内亚、阿拉斯加和撒哈拉以南非洲流行。

EBV病毒基因组分析对于研究病毒序列变异与EBV相关疾病之间的关联是必不可少的。从NPC中分离出各种EBV毒株并进行完全测序，包括从广东NPC患者中分离的两种毒株广东（GD）-1和2，从香港NPC患者分离的毒株HKNPC 1 -9和M81，从新加坡分离的毒株Yu 103，以及NPC细胞系衍生的C666-1毒株。EBV分离株表现出不同的表型特性，例如，M81株表现出对上皮细胞的向性增强和对B淋巴细胞的向性降低，这可能是由于糖蛋白gp 110的丰度。另一方面，Yu 103同时感染和转化B淋巴细胞和上皮细胞，因此具有驱动血液学和上皮恶性肿瘤的能力。

潜伏相关基因具有最高频率的SNP。值得注意的是，与其他EBV基因相比，LMP 1基因序列显示出高度的多态性。这些包括在胞质羧基（C）末端尾部的30个碱基对（bp）缺失，其与EBV相关肿瘤的更具侵袭性的表型相关。据报道，30 bp的缺失导致T细胞表位的密码子变异，导致潜在的逃避宿主细胞免疫识别。此外，涉及在位置169,425处的单核苷酸取代的点突变导致胞质氨基（N）末端尾的XhoI限制性位点的丢失这些突变被认为与NPC易感性相关。LMP 1基因异质性定义了几种变体，它们是阿拉斯加、中国1、中国2、中国3、地中海（Med）+、Med-和北卡罗来纳州。

EBNA-1 C端487密码子的多态性给予5种亚型，包括两种原型P-Ala和P-Thr以及三种变体V-Val、V-Leu和V-Pro。通常在来自亚洲患者的NPC活检中检测到的V-Val亚型可能通过增强病毒或细胞基因的表达而促成NPC肿瘤发生。NPC衍生的EBNA 1基因通常在其DNA结合结构域中具有多态性，导致DNA复制缺陷和附加体维持，这可能由于不稳定的潜伏感染和裂解周期基因的异常表达而增加NPC风险。

EBV裂解基因的变异导致NPC风险增加。在EBV基因组中携带三个非同义单核苷酸变体（BALF 2 162215 A> C [V700 L]、162，476 T > C [I613 V]和163364 C> T [V317 M]）的BALF 2 H-H-H地方性毒株与中国南方的NPC相关。SNPs 162、476_C和163364_T使中国南方人群患鼻咽癌的风险增加了6倍以上，累计占总风险的83%。BNRF1基因V1222I位点的氨基酸替换与中国人群鼻咽癌发病风险相关。BALF2和BNRF1的变化可能是由于病毒与宿主免疫系统的相互作用。

最近的研究确定了EBV基因组中与EBV风险相关的几种多态性。这些包括EBV编码的RPMS 1基因（G155391 A）内的单核苷酸多态性，据报道其与NPC的高风险相关。对RPMS 1基因多态性的进一步研究揭示了四种基因型，RPMS 1-A至D，由此该变异与地理区域和恶性肿瘤的类型相关。除此之外，在大约97%的NPC病例中检测到EBER基因内的四个碱基缺失。

病毒基因变异可能对鼻咽癌的发生具有影响作用，但EBV基因变异与鼻咽癌发病风险的关系尚不明确。此外，大多数关于EBV基因分型的研究仅限于某些地区。此外，据报道，EBV序列变异与宿主序列变异相关，因此，宿主和病毒基因组变异的联合分析将有助于破译NPC的发病机制并鉴定新的诊断和治疗靶标。需要招募更大样本的研究，涉及来自不同种族和地理区域的不同条件的个体，以确定EBV毒株与疾病的地理分布和发展的确切关联。进一步表征高风险EBV变异体中的突变将有助于描述发生在受感染宿主细胞中的分子机制。新技术的实施，如成簇规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9系统，将允许快速克隆和测定EBV变体的序列。

4.鼻咽癌中基于EBV的生物标志物

NPC的临床表现不明显，包括耳科疾病、颈部肿块、鼻部问题和头痛，以及其解剖部位隐匿导致诊断和治疗延迟，患者一般在症状发作后6周才开始就医。据报道，NPC患者的误诊率高达43.4%。根据AJCC/ IUCC第8版NPC TNM分期系统，早期（I期和II期）诊断的NPC患者的5年OS超过90%，而晚期诊断的NPC患者5年OS急剧下降，其中预测IVA期NPC患者的5年OS为73.7%。因此，早期诊断鼻咽癌对改善患者的生存和预后至关重要。鼻内镜检查结合活检病理分析仍是目前临床鼻咽癌检测的金标准。然而，该方法是侵入性的并且不适合于无症状个体。这就需要开发出一种具有高度特异性、敏感性、准确性和可靠性的非侵入性检测方法来诊断鼻咽癌。鉴于EBV与NPC之间的密切关系，EBV代表了用于开发NPC的筛查、诊断和预后生物标志物的有希望的靶点。

两阶段筛选模型用于流行区的人群筛选。该模型包括使用血清学或分子标记物的初级筛查方法，然后使用成像或内窥镜检查方法进行二级筛查。在NPC的流行区中使用免疫酶测定进行VCA/IgA和EA/IgA的常规联合检测，允许早期诊断NPC，诊断率范围为55 - 87%。如20世纪70年代首次报道的，NPC患者血清中EBV特异性IgA和IgG抗体滴度的增加为干预提供了理论依据。研究揭示了血清学窗口的存在，其中血清学EBV-VCAIgA抗体水平在NPC临床发作之前升高并持续，表明EBV-VCA IgA是NPC的早期标志物。开发用于检测多种EBV血清学标志物的ELISA技术，包括针对VCA、EA、EBNA 1、Zta和复制和转录激活因子（Rta）的免疫球蛋白，旨在提高筛查测定的准确性、灵敏度和特异性。血浆EBNA 1-IgA对早期鼻咽癌和正常人的鉴别诊断具有显著的特异性和敏感性，分别高达98.7%和91.5%。通过ELISA联合检测VCA-IgA和EBNA 1-IgA能够以提高的特异性和灵敏度诊断NPC患者。

通过使用靶向EBNA的常规PCR，Mutirangura等在31%的获自NPC患者的血液样品中检测到可能源自NPC肿瘤的EBV DNA的存在，并提示其作为诊断NPC的标志物的潜力。采用实时PCR（qPCR）策略靶向病毒基因组的BamHI-W和EBNA 1区域的病例对照研究，在来自NPC患者的超过95%的血浆中检测到无细胞EBV DNA。大规模结合基于qPCR的EBVDNA检测、鼻内窥镜检查和磁共振成像（MRI）的高危人群筛查允许鉴定早期NPC，特异性和灵敏度分别为98.6%和97.1%。与晚期NPC（98%）相比，EBV DNA检测早期NPC（90%）的灵敏度有限，这意味着需要进行平行筛查以提高诊断灵敏度。例如，EBV DNA和IgA-VCA作为标记物组的组合可以将诊断灵敏度提高到99%。此外，当与血浆EBV DNA相比时，可以在NPC患者的鼻咽拭子中检测到高水平的EBV DNA载量，其中假阳性和假阴性率较低，这表明鼻咽EBV DNA作为具有比血浆EBV DNA更低侵入性和更高准确性的替代物。除此之外，血浆EBV DNA的基于测序的检测显示出优于qPCR的上级阳性预测值，并且能够区分NPC和非NPC个体之间循环EBV DNA的分子特征，从而减少NPC诊断的假阳性。

血浆EBV DNA浓度与NPC患者的疾病分期、临床结果和总存活率相关，表明其作为分期和监测治疗效果的预后指标的潜力。治疗后血浆中检测不到EBV DNA的患者生存率更高，而治疗后血浆中存在EBV DNA则预示着远处转移。这表明，整合EBV DNA与其他临床病理参数治疗前，治疗期间和治疗后，可以促进结果预测，治疗策略定制，反应监测和治疗后监测。建立了结合EBV DNA载量和UICC/AJCC分期系统的预后列线图，用于局部晚期NPC患者的预后预测和治疗分层。最近的一项大规模研究建立了一个递归分区分析模型，根据EBV DNA载量和T分期将老年NPC患者分为危险组，并评估各组的化疗获益。在预后不良组中，由T3-4期的EBV DNA载量小于4，000拷贝/mL或任何T期的EBV DNA载量大于4，000拷贝/mL定义，与仅接受放疗的患者相比，接受放化疗的患者具有显著改善的OS。治疗前和治疗后血浆EBV DNA滴度预测疾病进展、转移、复发和死亡的风险，因此是用于预后分层和治疗后肿瘤监测的有希望的生物标志物。然而，检测方法的异质性和缺乏标准化的参考系统导致实验室间的差异。因此，标准化的方法和截止值的EB病毒DNA检测是必要的，以确保重现性和提高效率的标志物。

此外，EBV编码的miRNAs也成为鼻咽癌诊断和预后的潜在生物标志物。使用qPCR的miRNA谱检测了一系列EBV编码的BART miRNA的升高，包括原发性NPC患者的血浆样品中的BART 2 - 5 p、BART 6 - 3 p、BART 7 - 3 p、BART 7 - 5 p、BART 9 - 5 p、BART 11 - 3 p、BART 17 - 5 p和BART 19 - 5 p，其中BART 19 - 5 p显示出检测具有不可检测的血清EBV DNA的患者中的NPC的最佳性能。血清miRNA BART 2 - 5 p允许以90.9%的灵敏度和54.5%的特异性从高风险人群中鉴定临床前NPC。此外，BART 2 -3p、BART 2 -5p、BART 5 -3p、BART 5 -5p、BART 6 - 3 p、BART 8 - 3 p、BART 9 - 5 p、BART 17 - 5 p、BART 19 - 3 p和BART 20 - 3 p与复发性NPC相关，其中BART 8 - 3 p和BART 10 - 3 p表现出区分EBV DNA不可检测的复发性NPC的最高能力。在NPC患者血浆中检测到大量的miRNAs BART 7和BART 13，其水平随着疾病的进展而增加。miRNABART 7和BART 13可以作为预后生物标志物，其提供关于疾病阶段和治疗功效的有用临床信息。应进行大规模研究以进一步验证EBV编码的miRNA作为NPC生物标志物的有效性。

为了便于将这些生物标志物整合到临床应用中，方法和临界值应标准化，以产生准确和可重复的结果。此外，应进行考虑地理、遗传和环境因素的大规模临床研究。对大数据分析的研究将揭示疾病模式及其相关因素。从基因组学、蛋白质组学、成像、血清学特征、人口统计学等方面整合患者信息，可以为每个人定制个性化的治疗策略。人工智能的发展是为了提供对精准医疗干预策略的见解。研究人员开发了机器学习和深度学习模型，通过整合多个临床参数，包括图像，人口统计学特征，血浆EBV-DNA，血清生化特征，治疗方案等，预测NPC患者的生存，疾病进展和治疗反应。

5.靶向治疗鼻咽癌的临床和临床前研究

在过去的几十年里，NPC管理的进步已经为患者的预后带来了显着改善。根据美国国家癌症综合网络（NCCN）指南（v 1.2018）和ESMO-EURACAN指南，目前NPC患者的治疗策略主要基于AJCC/IUCC分期。调强放射治疗是目前治疗早期鼻咽癌（I-II期）的基准，局部控制率超过90%。不幸的是，近70%的患者在诊断时表现为局部晚期疾病，导致预后不良。在晚期疾病（III-IVb期）患者中，在放射治疗的同时加入顺铂化疗显著改善了预后结果。尽管NPC患者的临床获益显著改善，但接受IMRT的患者中有5 - 15%会发生局部失败，而15 - 30%的患者会发生远处失败。此外，患者还遭受晚期毒性，例如神经损伤和听力损失。针对鼻咽癌特异性分子靶点的有效治疗策略的开发将提高癌症治疗的疗效，同时降低其毒性和成本。在未分化的NPC病例和癌前病变中EBV的存在暗示EBV在NPC的发展中的重要作用。鉴于EBV在NPC中的致癌作用，研究已经开发了各种靶向EBV的方法，包括免疫治疗、裂解再活化、潜伏蛋白靶向肽和基因治疗。

5.1.免疫治疗

针对NPC中EBV的基于细胞的免疫治疗可以进一步分为两种方法，被动免疫治疗或过继免疫治疗以及主动免疫治疗或癌症疫苗。连续性免疫治疗包括向NPC患者输注靶向EBV的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。自体EBV特异性效应T细胞包括使用自体EBV转化的淋巴母细胞系（LCL）离体再活化的多克隆T细胞系和使用重组病毒载体或肽选择性再活化的T细胞。I/II期临床研究报道了免疫疗法的安全性和良好耐受性，所述免疫疗法涉及通过用EBV转化的LCL刺激离体产生的自体EBV-CTL的过继转移，尽管效力有限。输注后，患者显示EBV病毒载量减少，对化疗的反应改善。与仅接受化疗的患者相比，给予化疗剂吉西他滨和卡铂联合EBV-CTL过继转移的晚期NPC患者显示出改善的临床结果，中位总生存期从17.7个月改善至29.9个月，2年OS率从29.5%增加至62.9%。目前正在亚洲和美国进行一项III期临床研究（NCT 02578641），以进一步评估EBV-CTL过继免疫治疗与吉西他滨-卡铂化疗联合治疗的安全性和疗效。尽管在患有局部疾病的患者中观察到有效的抗肿瘤活性，但患有转移性疾病的患者仅显示出有限的抗肿瘤活性。此外，该方法优先扩增在NPC中不表达的EBNA 3特异性T细胞。LCL扩增的EBV特异性CTL的产生是耗时的，需要约8至22周，并且是劳动密集型的。

或者，通过用基于腺病毒的载体刺激产生EBV特异性CTL，所述载体编码与来自LMP 1和2的CTL表位融合的截短的EBNA 1（AdE 1-LMPpoly）。与LCL扩增的EBV特异性CTL相比，该方法是快速的，并且产生具有改善的功能和细胞溶解潜力的T细胞。在预防性和治疗性环境中，使用AdE 1 LMP多扩增T细胞的过继免疫治疗在NPC患者中耐受良好。与未接受CTL的患者（220天）相比，接受CTL的患者的中位OS延长至523天。免疫应答然而是短暂的，并且仅观察到EBV DNA载量的最小下降。另一种方法涉及T细胞的遗传修饰，以通过表达嵌合抗原受体（CAR）来识别肿瘤特异性抗原。靶向LMP 1的CAR-T细胞在体内异种移植模型中显示出LMP 1特异性细胞溶解作用和对过表达LMP 1的肿瘤的显著生长抑制作用。另一方面，T细胞受体（TCR）基因转移已被开发作为一种替代方法，具有提高的效率，可靠性和减少的时间消耗，以产生大量的T细胞靶向EBV编码的癌蛋白具有高亲和力。观察到小鼠中肿瘤生长的显著减少，目前正在中国进行一项正在进行的II期临床研究（NCT 03648697），以评估EBV-TCR-T（YT-E001）细胞在NPC患者中的疗效。

以EBV为靶点的免疫治疗是一种有前途的治疗鼻咽癌的策略，具有最小的毒性和长期的临床效益。提出了几种策略，以提高治疗方法的质量和疗效。这包括预测性生物标志物如IP-10和MIP-3a的发现，以及预后性生物标志物如EBV-DNA将有助于鉴定可从治疗计划中受益的患者。EBV特异性CTL在体内的有限扩增可能限制抗肿瘤活性。CD 45单克隆抗体（mAb）介导的淋巴细胞清除可以通过升高细胞因子IL-7和IL-15的血浆水平、清除调节性T细胞和增加抗原刺激来刺激输注的EBV特异性CTL的扩增。EBV特异性CTL上的共抑制受体如PD-1和CTLA-4的表达可能与其有限的抗肿瘤细胞毒性相关，因此，免疫检查点阻断可能有助于增强治疗功效。缺乏合适的NPC动物模型来评估EBV靶向免疫治疗的治疗潜力是其临床前验证的主要障碍，导致临床前和临床结果的差异。这突出了对重现人类免疫系统和肿瘤微环境的临床前模型的需求。

除此之外，通过病毒载体或抗原呈递细胞递送EBV特异性抗原（包括LMP 1、LMP 2和EBNA 1）的肿瘤疫苗被设计为增强肿瘤特异性免疫。MVA-EL是一种表达由LMP 2中的HLA I类限制性表位和EBNA 1中的HLA II类限制性表位组成的嵌合抗原构建体的重组修饰的安卡拉牛痘，其在体外有效地激发CD 8+和CD 4 + T细胞应答。在香港和英国的NPC缓解期或持续性疾病患者的I期临床试验中，据报道，该疫苗在不同的EBV株和HLA变异中表现出令人满意的安全性和耐受性以及免疫原性。体外研究表明，EBV-LMP 2重组腺病毒疫苗诱导的LMP 2特异性CTL通过穿孔素/颗粒酶和Fas/FasL途径对肿瘤细胞产生细胞毒作用。

另一种策略涉及表达离体产生的EBV特异性抗原的自体抗原呈递细胞。通过用编码截短的LMP 1和全长LMP 2的腺病毒（Ad-Δ LMP 1-LMP 2）转导产生的树突细胞（DC）疫苗在对转移性患者的II期临床试验中仅显示有限的功效。另一种LMP 2-DC疫苗是用表达LMP 2的腺病毒载体（rAdLMP 2）感染自体DC产生的，其可诱导特异性针对LMP 2的CTL应答，有助于防止NPC的复发和转移，特别是在早期阶段。

靶向EBV编码产物的肿瘤疫苗在不同种族中耐受性良好，并且不良事件最少。然而，在患有晚期NPC的患者中报道了有限的功效，这可能是由于TdR的流行和肿瘤微环境中共抑制分子的存在。未来需要招募更大队列的多中心临床试验，以进一步评估这些疫苗治疗NPC的疗效，确定可能从干预中受益的群体，并评估EBV靶向疫苗的长期治疗效果。研究还应调查治疗性疫苗接种与其他方式（如化疗和过继免疫治疗）之间的潜在协同作用，以提高其疗效。使用溶瘤病毒的病毒疗法代表了一种新型的癌症治疗剂，其充当除了直接诱导癌细胞死亡之外还刺激宿主的抗肿瘤免疫的癌症疫苗。这些包括单纯疱疹病毒G47Δ和Pteropine Orthoreovirus 7S，它们在体外表现出对NPC的抗肿瘤活性。溶瘤病毒已被基因工程化以表达细胞因子、共刺激分子、免疫检查点抑制剂或双特异性T细胞增殖剂（BiTE）分子，以增强抗肿瘤免疫应答并抑制肿瘤耐受性。例如，编码HPV致癌基因E6和E7的溶瘤腺病毒MG 1在临床前研究中证明了肿瘤特异性应答，并且目前正在进行涉及HPV相关恶性肿瘤患者的I期临床试验。因此，溶瘤病毒代表了开发针对EBV相关NPC的治疗工具的有吸引力的靶标。

5.2.溶细胞病毒活化疗法

溶细胞病毒活化疗法旨在重新激活潜伏EBV中的裂解周期，从而诱导免疫原性蛋白和病毒激酶的表达，使细胞对抗病毒免疫应答或疗法敏感。所涉及的化学裂解诱导剂包括常规化疗剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、蛋白激酶C（PKC）调节剂等。化疗药物，包括顺铂和5-氟尿嘧啶，通过p38应激MAPK、P13激酶和PKC-δ途径诱导感染恶性细胞的EBV中的潜伏裂解开关，从而触发病毒激酶如蛋白激酶（PK）的从头表达，所述蛋白激酶将类似物抗病毒前药更昔洛韦转化为抗病毒药物活性细胞毒性形式以杀死EBV阳性NPC细胞。组蛋白脱乙酰酶的抑制剂如辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）或伏立诺他和罗米地辛诱导EBV裂解周期，同时表达裂解蛋白，导致细胞凋亡和抑制NPC中的肿瘤生长。苯丁酸钠（NaPB），一种PKC调节剂可以上调EBV阳性肿瘤细胞中的EBV胸苷激酶（TK）活性，使它们对抗病毒药物更昔洛韦敏感。铁螯合剂（包括C7）和二-2-吡啶基酮4，4-二甲基-3-缩氨基硫脲（Dp 44 mT）通过细胞外信号调节激酶（ERK）介导的自噬和通过HIF-1α诱导的缺氧信号传导重新激活EBV裂解周期。研究报告了化学裂解诱导剂组合的协同效应。例如，化疗剂吉西他滨与组蛋白脱乙酰酶抑制剂丙戊酸导致EBV的裂解周期的更强诱导。蛋白酶体抑制剂硼替佐米和SAHA的组合协同激活EBV裂解周期并诱导ROS驱动的半胱天冬酶依赖性凋亡，从而抑制体内肿瘤活跃生长。

初步和I-II期临床研究报告，溶细胞病毒活化疗法联合吉西他滨、丙戊酸和更昔洛韦耐受性良好，有助于晚期NPC患者的疾病稳定。免疫应答受到限制，可能是由于肿瘤微环境的免疫调节作用。未来的研究应探讨裂解诱导后肿瘤和免疫反应的确切分子机制，以提高治疗策略的疗效。细胞内铁螯合作用的影响，建议纳入临床上可用的铁螯合剂的鼻咽癌患者。进一步的临床研究将有助于评估NPC患者的最佳剂量和药物组合方案。

5.3.其他

靶向EBV编码的潜伏蛋白肽被设计用于癌症监测和精确的癌症治疗。合成组合荧光团L2和EBNA 1特异性结合肽P4的探针作为治疗诊断剂，其允许当定位于EBV阳性NPC细胞的细胞核时肿瘤的可视化和通过干扰EBNA 1的同源二聚化抑制肿瘤生长。将锌螯合剂（ZRL 5）掺入P4中可以更有效地中断EBNA 1的寡聚化，以抑制生长并重新激活EBV裂解周期，导致EBV阳性NPC肿瘤缩小。在另一项研究中，P4与镧系上转换纳米颗粒缀合以形成UCNP-P4进一步增强了其稳定性和生物相容性，并为成像和肿瘤的更特异性靶向提供了更强的信号传导。双靶向EBV癌蛋白的pH响应性肽UCNP-P5的构建进一步增强了药物的特异性和功效，同时减少了临床前体内和体外模型中不期望的副作用。

通过切割RNA的脱氧核酶（DNAzyme）基因操纵LMP 1的表达已被积极研究作为一种潜在的治疗鼻咽癌的方法。DNA酶可抑制LMP 1的表达及其下游通路，包括AP 1、NF-κB和JAK/STAT通路，从而导致DNA损伤以及细胞周期阻滞、促进凋亡和增强体外和体内NPC模型的放射敏感性。靶向LMP 1的DNA酶通过抑制LMP 1/JNKs/HIF-1/VEGF介导的血管生成和抑制LMP 1/Akt诱导的端粒酶活性而有助于抑制NPC中LMP 1诱导的放射抗性。肿瘤内给予EBV-LMP 1靶向DNAzyme联合放疗的早期临床试验报告了短期肿瘤消退的显著减少，与联合治疗相关的不良事件最少。

在过去的几十年中，已经提出并实验了几种靶向EBV的策略，包括过继免疫疗法和癌症疫苗、溶细胞病毒活化疗法、EBV编码的癌蛋白靶向肽和遗传疗法。除了广泛研究的EBNA 1和LMPs外，EBV衍生的RNA（包括EBER）的不可避免的致癌作用促使进一步研究作为有希望的治疗靶点。NPC患者对EBV靶向治疗有反应，因此，预测性分子标记物的鉴定对于个体患者个性化治疗策略的分层至关重要。然而，这受到具有稳定遗传畸变的可靠NPC模型的有限可用性的阻碍。因此，需要更多基因组特征的患者来源的NPC模型来阐明决定患者对EBV靶向治疗的反应的特定分子参与者。除此之外，EBV也是肿瘤特异性药物递送的一个有吸引力的靶点，它可以提高药物的效力，同时最大限度地减少患者的不良反应。除了上述探测的纳米颗粒之外，外泌体也是用于肿瘤特异性药物递送的有前景的载体。基因组编辑工具，如CRISPR-Cas可能介导精确靶向病毒基因组用于抗肿瘤治疗。最后，建议结合不同的治疗策略进行研究，以研究它们的协同作用，并为NPC患者设计最佳的治疗方案。

6.结束语和未来展望

EBV是一种与鼻咽癌密切相关的致癌病毒，EBV感染在鼻咽癌发生发展中的作用可能是通过异常诱导癌前病变上皮细胞潜伏期而实现的，其确切的分子机制尚不清楚。EBV与鼻咽癌相关性的临床前研究受到代表性模型有限的阻碍。在NPC的细胞培养物中报道了细胞增殖和遗传污染后EBV附加体的快速损失。向上皮细胞中加入ROCK抑制剂Y-27632抑制了它们的分化并促进了EBV阳性细胞系NPC 43的建立。建立更有效的体外模型来研究EBV感染和细胞转化，将有助于深入了解宿主细胞、病毒和肿瘤微环境之间的相互作用。此外，患者来源的异种移植物可以重现NPC患者的突变谱，并促进精准医学的转化研究和开发。尽管EBV感染广泛，但NPC显示出偏态的地理和种族分布，表明EBV基因异质性的作用。实施更敏感和有效的技术，用于病毒基因组测序和EBV毒株的克隆结合EBV序列异质性的表型研究，将有助于鉴别与NPC相关的高危EBV变异体，以及序列变异在肿瘤发生、癌症进展、生存结果和治疗反应中的作用。这些知识也将有助于识别具有NPC易感性的高危人群，并制定预防策略或基于EBV的NPC治疗方法。

EBV血清学检测EBV DNA水平和针对EBV癌蛋白的抗体有助于检测早期NPC、预测预后和监测患者的反应。因此，开发具有高灵敏度和特异性的诊断和预测生物标志物对于早期发现NPC并提供更高准确性和精确度的预后信息至关重要。需要采用标准化方法和临界值的大规模国际研究来提高标记物的有效性。需要将基于EBV的签名与其他NPC生物标志物（例如NPC相关基因组多态性）相结合的研究，以进一步提高其早期诊断效率并预测治疗反应和复发风险。使用人工智能整合患者的基因型和表型特征，可以以具有成本效益和时间效益的方式促进风险分层和决策。

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