[导读] 作者：清华大学附属北京清华长庚医院病理科 高国强 杨江辉
时至今日，科技发展的速度如同插上了翅膀飞速向前，种种新技术粉墨登场。借助新兴科技力量，医学发展也一日千里，多种多样的新兴治疗手段让人目不暇接、眼花缭乱。然而，“万变不离其宗”，医学归根结底来说无非是诊断和治疗两个部分，作为“诊断金标准”的病理诊断在整个医疗行为过程中举足轻重，甚至有些时候会成为指导临床治疗的“灯塔”。
病理技术最经典的是石蜡包埋--HE染色制片技术，除此之外，我们在这一技术的基础上还经常用到一些辅助检查方法，或者叫做特殊检查方法。这些检查方法往往操作简单、方便快捷、结果可靠、价格低廉，却给我们的病理诊断工作解决了不少难题，在病理诊断中起到了“四两拨千斤”的效果。
一、连切、深切：“不知细叶谁裁出，二月春风似剪刀”
病理学检查方法主要是将手术切除标本制作成切片后在显微镜下观察来对病变做出诊断。在病理诊断过程中，病变可能较为表浅也可能浸润较深，或者仅观察单一切片不足以确定病变性质，只有看到组织不同深度或者连续变化才能得到最终结论。
这个时候只需要一个细小的动作就可以解决---连切、深切。连切是指在已经切取切片的蜡块上直接连续切片，深切是指在已经切取切片的蜡块上向深处修块，再切片。
当然这个细小的工作，犹如“春风拂柳”般轻巧，同时报告可能会推迟一天，需要临床医师和患者谅解，但是对于诊断结果来说，会更精确、更完善。
连切操作及HE染色镜下
二，特殊染色：“曾经沧海难为水，除却巫山不是云”
病理技术学中，常规HE染色技术的显色效果对于细胞核、细胞质区分很明显，但对于组织中的一些特殊成分如结缔组织和肌纤维、病原微生物、病理性沉着物、色素、糖类、酶类等等却没有很好的分辨效果，很多相关疾病诊断就成了难题。
这就需要用到区别于HE染色的特殊染色方法，特殊染色是指应用某些试剂或染料与组织细胞内的化学成分进行特异性反应或染料分子结构的某些基团与组织内的相应基团特异性结合而显色。每种特殊成分有其对应的特殊染色方式，从而呈现出不同的显色结果。这种特殊成分与染色方式之间的对应关系犹如爱情的忠贞：“曾经沧海难为水，除却巫山不是云”。
比如常用的显示肝糖原的高碘酸-无色品红（PAS）法。先用高碘酸氧化组织切片，使组织中含有己糖结构的碳键打开，生成二醛；二醛与无色品红结合生成紫红色颗粒状复合物定位于肝细胞胞质中；从而证明糖类物质的存在。用另外一张连续切片经淀粉酶消化后（淀粉酶可以水解糖原）同时做PAS对照，如对照片呈阴性，就可确定阳性物为糖原。PAS染色可以确定肝细胞内糖原的存在，通过观察肝糖原在肝细胞的含量和分布及变化，可了解肝细胞的功能状态。
特殊染色操作及特殊染色-Ag染色镜下
三， 免疫组化：“闲潭云影日悠悠，物换星移几度秋”
在组织切片中，某些疾病的表现极其相似，肉眼难以分辨。在病理学早期的发展过程中，对于这类疾病的诊断，只能凭借经验判断，往往各个专家各执一词，莫衷一是，难以形成正确、统一的诊断，极大限制了病理学的诊断意义和价值。
于是免疫组化方法应运而生，免疫组化方法基于抗原抗体特异性结合原理，而其独特之处在于将其结合物像蝴蝶效应那样逐步放大，最终经过显色清晰的呈现出来，从而能够实现对组织和细胞内的特定抗原和抗体进行定位、定向或定量检测。
免疫组织化学染色方法很多，但考虑到方法的特异性和敏感性、操作简单方便和价格等因素，临床上多采用的是LSAB（S-P）法。具体操作流程如下：
1.准备工作：抗原修复和内源性酶的抑制
抗原修复目的是将被封闭的抗原结合位点重新暴露；进行内源性酶的抑制则是因为组织中的内源性酶易与显色物质DAB结合，造成非特异性背景染色。
2.核心工作：抗原、抗体结合与结合物放大
一抗工作液与组织中抗原特异性结合，生物素化（生物素化即生物素与抗体结合。生物素可以与多种酶结合，而不影响抗体与抗原结合的能力）二抗与一抗特异性结合，三抗酶复合物与生物素化二抗结合，使抗原抗体结合物放大。
3.收尾工作：显色。
常用DAB做显色剂。
经过一系列“物转星移”的变化，就可以把不同组织、不同部位的特异性抗原标记出来，作为诊断的依据，从而大大提高了诊断准确性、促进了诊断的标准化。
免疫组化操作及免疫组化-ki-67染色镜下
除此之外，还有电子显微镜检查，可以通过研究生物组织的超微结构来认识疾病的发生。因其多应用于科研及教学，临床上应用较少，在此不再赘述。
总之，在疑难病例的诊断过程中常常会用到以上特殊检查方法。根据不同的诊断需要，选择灵活的检查方式，是实现顺利诊断的有效途径。而且，这些特殊检查方法中的具体内容会越来越丰富。
新时代下的医学发展，分子领域不断扩展，分子病理学技术作为新兴的病理学诊断辅助技术之一，随着技术的稳定成熟，也将越来越广泛应用于临床病理诊断；人工智能异军突起，新的思维方式、观念让人们不断冲破传统的禁锢；更高的经济发展水平、更多样化生活方式对医疗水平、医疗服务提出了更高、更多元化的要求。
“船到中流浪更急，人到半山路更陡”，继承前辈筚路蓝缕，披荆斩棘奠定的学科基础，充分发挥我们病理人的智慧，吸收最高的科技成果应用到我们的实际工作中，是我们共同的责任。加速奋进的年代正是我们辉煌灿烂的发展契机，“愿乘风破万里浪，直挂云帆济沧海”，让我们同舟共济，继往开来。
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