ALK靶向药物克唑替尼去年被纳入国家医疗保险，每月患者的治疗费用从5万降到1万多，对患者及国家而言都非常利好。而ALK第二代药物阿来替尼在2018年也被批准中国上市，中位无进展生存期达到空前的34.8个月，且可突破血脑屏障，将患者脑转移风险降低84%。不言而喻，ALK用药前的检测也显得更为重要，蛋白方法IHC与分子平台FISH、RT-PCR、NGS等的检测不一致病例在临床中也会更多碰到。本文着重从文献角度分析基于形态的两种主流方法IHC与FISH检测的典型和不典型异常，及两种结果不一致的原因分析，供大家参考。

如上左图：ALK蛋白结构域；上右图：克唑替尼与ALK蛋白的相互作用图。

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在《中国间变性淋巴瘤激酶（ALK）阳性非小细胞肺癌诊断专家共识（2013版）》中，明确推荐D5F3（Cell Signaling公司）和5A4（Abcam公司）克隆号抗体检测ALK融合蛋白，且《共识》中列举了IHC不同表达程度与FISH阳性的关系如下表：

需要说明：《共识》中指出常规IHC的阳性标准判定尚未统一。推荐常规方法IHC的判读标准如下：IHC 3+：>5%的肿瘤细胞呈现颗粒状细胞质强着色；IHC 2+：>5%的肿瘤细胞呈现中度细胞质着色；IHC 1+：>5%的肿瘤细胞呈现微弱或模糊的细胞质着色或小于等于5%的肿瘤细胞有任何程度的着色；IHC 0：肿瘤细胞无着色。而罗氏公司开发的Ventana ALK融合蛋白IHC诊断试剂盒采用二分类系统，即仅为阳性和阴性两种，阳性结果即可诊断为ALK阳性NSCLC。

然而，国内周晓军等人（2015）比较了手工IHC ALK四种抗体与FISH阳性的相关性，不同抗体间的灵敏度存在较大差别，D5F3的表达强度优于5A4，在IHC 3+/2+样本中的比例相对更高，灵敏度明显更优（93.8% vs 56.3%）但两者的特异性相当。如下图：

如上图：（A）穿刺样本，Ventana机染IHC D5F3；（B）手工IHC克隆1A4/1H7；（C）穿刺样本，弱的胞浆表达，1+；（D）弥漫胞浆表达，染色均匀，3+。

如上图：FISH与D5F3、5A4表达对比，D5F3强度明显优于5A4。(J Thorac Oncol. 2015)

如上图，FISH结果与5A4 IHC不同程度结果符合率。3+中较高（20/22），但1+中仅有2/48。（J Clin Oncol 2014）

如上图：不同克隆号的ALK抗体机染、手工的protocol文献汇总。

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《共识》中指出，建议优先对这些临床病理特征样本进行筛选，包括黏液型腺癌、含印戒细胞成分、不吸烟、年龄<60岁。但这些特征并非排他性的，即对其他疑有ALK融合变异患者均可检测。并且，《共识》指出，对于部分无条件行Ventana IHC检测的医疗机构，常规ALK IHC可作为替代的筛选方法，但阳性标本需以FISH、Ventana IHC或PCR进一步确诊。

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NSCLC中，ALK易位与人种（西方/亚洲/混合）、组织学（腺癌/鳞癌）、性别、吸烟状态、肿瘤分期、年龄、与EGFR突变、KRAS突变的荟萃分析见下图文献综述，涵盖了62篇paper数据。

如上左图：NSCLC中ALK与EML4融合有多种变体，表现为ALK的断裂位点恒定（Exon20），而EML4有多个不同断裂位点；上右图：EML4-ALK不同融合变体的发生率，需要注意，还有约10%为“Unknown”的变体。所以，ALK断裂探针在变体众多的融合基因检测上具有天然优势。（The Oncologist, 2012）

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Abbott的ALK FISH探针在临床应用上做为伴随诊断试剂，积累了大量临床数据。ALK与EML4都在2号染色体的短臂（2p），ALK是从右至左转录的（5’在右侧），且与EML4仅相距12M（EML4在ALK基因的右侧，靠着丝粒端）。ALK 断裂位点恒定，在20外显子处（靠近3’端），由于ALK是与EML4发生倒位融合的（位于两基因断裂位点之间的序列调转过来），所以Abbott的ALK FISH探针的绿色端设计在ALK基因上，且靠近20外显子断裂处（靠近3’端），红色端紧挨着ALK 3’端，这样的话ALK与EML4发生融合时就红绿信号分离开来了。

如上上图：Abbott的ALK断裂FISH探针设计；上下图：ALK与EML4发生倒位融合示意图。

需要注意：常规FISH基因探针的信号大小约为几M基因组距离（与细胞核大小、染色质松散程度相关）。ALK与EML4倒位后，红绿探针在基因组距离上也就相差12M作用而已，对应的空间距离也不会太大（比不同条染色体易位的近，如BCR/ABL），但也不会太小（比如毛细胞星形细胞瘤中BRAF-KIAA1549仅相距2M，阴阳性就不好区分了），但典型的断裂开来的阳性红绿信号分开的距离会大于2倍信号直径。值的指出，文献也多引用“2倍信号直径”这一说法，但也有少量文献是“1倍信号直径”。

不过，根据我们的经验，12M这一基因组距离说大不大，说小不小，且在细胞核相对不大或染色质致密的样本中、或受样本处理的影响（如煮片的力度大小），也多有可能会出现红绿介于1倍-2倍信号直径之间的距离。那究竟判阳还是判阴，还需根据整体镜下阅片情况、肿瘤细胞多少等斟酌，最好是用不同方法学来验证（如RT-PCR或NGS）。

如上左图：大于2倍信号直径判为阳性；上右图：上端两处箭头所示为阴性，中间箭头所示为阳性。（The Oncologist, 2012）

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ALK判读中，经常会碰到阳性阈值的问题。Abbott的说明书中15%是建立在较大样本量上分析而来的数据，如下图。但处于灰区“borderline，15-20%”时需额外计数细胞（如25个）来加以判断，且Abbott的说明书中都给出了指引。然而，处于15-20%的样本比例并不高，见下列文献引用。但阳性细胞比例不够15%或处于灰区是造成IHC阳性而FISH阴性的主要原因。

如上左图：ALK阴、阳性细胞比例的统计学分析，定为阈值15%可很好地区分ALK阴性样本（53例）和阳性样本（13例）；上右图：三个中心（美国/日本/法国）显示阴性样本中阳性细胞比例约介于3.5%-9.5%。（The Oncologist, 2012）

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6：除了1红1绿1黄外，ALK还有单红1黄的不典型阳性类型。如上所述，绿色探针标记在20外显子的右端，而ALK和EML4在倒位融合过程中也可能会发生缺失（导致绿色信号丢失），但EML4区段已与ALK酪氨酸激酶区段形成融合蛋白，所以这也是阳性的类型。

如上左图：单红1黄也为ALK阳性。上右图：典型阳性信号（1红1绿1黄）在三个中心中的比例分别为54%（美国）、90.5%（法国）和73.7（韩国）；而不典型阳性（单绿1黄）则分别为37%、9.5%和26.3%。也就是说典型阳性比不典型阳性更为多见。

不同阳性类型的阳性细胞数分布也不一，且跨度也较大，典型阳性为18%-82%；而不典型阳性可能由于例数较少，其平均阳性细胞比例更高一些74%。

如上图：典型阳性和不典型阳性两者的性别、年龄、种族、吸烟状态对比数据。

而不典型阳性病例可能与克唑替尼治疗的疗效也有关系。如下图数据：

如上图：ALK FISH和IHC不符样本的信号类型（典型vs不典型）与拷贝数增加及疗效的关系。（Oncology Reports, 2016）

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然而，随着数据的积累，越来越多的不典型阳性、或复杂异常被发现。如红绿分开伴多黄、单红多黄、2个都为红绿分开等。这也可理解，越复杂的信号表现，就意味着越复杂的基因组异常。这类异常是很容易理解和直观的。

如上图：表现为2个都为红绿分开、单红伴3黄。

如上图，部分ALK阳性样本伴有拷贝数增加异常（多体或扩增）。

如上图，NSCLC和non-NSCLC中，ALK阳性病例可伴有很多基因的点突变，前三位为TP53、CDKN2A和CDKN2B，且NSCLC中出现的基因异常频率比non-NSCLC的高。这也说明NSCLC的基因异常谱更为复杂。

但有一些隐匿的情况，会导致IHC阳性但FISH阴性的结果，临床处理比较困惑。有学者专门做了总结图，总体而言就是ALK-EML4倒位融合后且伴有不同位置或区段的缺失，而导致红点缺失、或红绿都缺失等情况，导致不满足上述两类阳性信号类型的判读。

如上图，某学者的PPT课件，情况D-G都可导致出现1绿1黄、或1黄、或2黄等阴性信号类型，导致出现假阴性。（抱歉，图片来源不详，如有侵权请联系删除）

如上图：一例不典型阴性结果异常，伴有多个单绿和1个黄色信号。此例样本经RT-PCR验证为EML4-ALK融合阳性。（Journal of Thoracic Oncology, 2014）

如上图：IHC与FISH结果不符患者的总生存期比较。(J Clin Oncol. 2014)

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然而，还有FISH阳性但IHC阴性的这类情况不符。有个别病例克唑替尼的疗效并不明显，原因未明。下图是其中一例FISH呈5’缺失的单红1黄阳性但IHC阴性、且NGS也为阴性但伴有KRAS阳性的患者，克唑替尼治疗8周后肿瘤体积反而增大30%。(J Thorac Oncol. 2015)

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另外，ALK除了断裂阳性外，还可伴有拷贝数增加，且比较常见。在ALK FISH阴性患者中出现拷贝数增加的比例会更高。比如下面罗列的两篇大宗数据。

西班牙1000例数据中(J Thorac Oncol. 2014)，发现有高达710例（65%）出现拷贝数增加（Copy number gains，CNG），且在其中的大部分细胞中都会出现（介于40%-95%）。FISH分析显示有43例（3.9%）在不到10%细胞中可伴有扩增，其中有21例表现为扩增簇和22例平均每细胞有超过6个ALK信号。在这些43例扩增的样本中，表现为扩增的细胞数量介于15%-60%。需要注意，有9例（0.8%）表现为一个细胞中只有一个ALK信号，提示为2号单体。

如上图：ALK FISH断裂阳性与ALK/CEP2拷贝数增加（扩增）、c-MET表达、ROS1表达等异常的关系。其中在ALK FISH 26例阳性样本中拷贝数增加介于3-6个的比例高达70%。

如上图：1：ALK断裂阴性；2：ALK典型阳性（1红1绿1黄）；3：ALK不典型阳性（1红1黄）；4：ALK多体阴性。

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另外一篇超大量样本的数据（114200例，其中NSCLC21500例（18.8%），其他肿瘤类型92678例（81.2%））用测序分析的方法显示，有876例（0.8%）为ALK融合阳性，其中675例（77.1%）存在于NSCLC，而在其他肿瘤中为201（22.9%）。也就是说，ALK融合在NSCLC中（占3.1%）比其他肿瘤更为常见。而非NSCLC肿瘤伴有ALK融合的患者显得更为年轻、且女性居多。并且，在NSCLC中，ALK与EML4融合更为常见（占83.5%）；而在其他非NSCLC肿瘤中ALK-EML4融合却仅占30.9%。（The Oncologist 2017）

如上图，NSCLC和non-NSCLC ALK阳性特征的对比。特别要注意，NSCLC中ALK主要是与EML4融合，但在non-NSCLC中ALK与非EML4基因融合的比例会更高（15.2% vs 9.6%）。

如上图，NGS发现ALK与众多基因融合的频率，NSCLC和non-NSCLC中的基因种类及丰度都不相同，且NSCLC中的基因融合种类更多，这也说明NSCLC的基因异常谱更为复杂。另外也说明，ALK断裂探针比PCR和测序方法更为简单实用，无论与哪个基因融合，都可检测出来。

ALK融合阳性的非NSCLC肿瘤多为上皮和间叶细胞肿瘤，且抗ALK治疗也有效。在其他肿瘤中为ALK阳性的201例病例中，病例较多的病种包括有：子宫平滑肌肉瘤（13例），原发灶不明的未分化神经内分泌癌（4例），原发灶不明的鳞状细胞癌（4例），原发灶不明癌（10例），原发灶不明腺癌（15例），乳头状甲状腺癌（5例），软组织肉瘤NOS（10例），软组织神经纤维瘤（4例），软组织平滑肌肉瘤（7例），软组织炎性肌纤维母细胞肿瘤（17例），软组织组织细胞增多症（4例），大B细胞淋巴瘤（7例），间变性大B细胞淋巴瘤（17例），结直肠癌（11例），乳腺癌NOS（5例）。

而这些ALK阳性的876例患者，可发生于身体的多个部位。肺（265例），淋巴结（143例），胸水（83例），肝（69例），软组织（16例），脊柱（6例），卵巢（3例），纵膈（5例），头颈（6例），胸膜（8例），脑（37例），骨（10例），肾上腺（5例），子宫（2例），胃（3例）。

如上图，一例伴有EML4-ALK融合的肾细胞癌患者用第二代药物阿来替尼治疗后肿物显著缩小。

如上图，胸水细胞制成细胞块，行H&E和IHC ALK检测。（PLOS ONE 2015）

如上图，炎性肌纤维母细胞肿瘤中可伴有多种TKI靶标基因异常，如ALK、ROS1和PDGFRB，可行对应靶向治疗。（DOI: 10.1158/2159-8290.CD-14-0377）

部分引用文献：

1:Zhou Xiaojun et al. 2015. Comparing  four different  ALK  antibodies with  manualimmunohistochemistry  (IHC)  to screen  for  ALK-rearranged  non-small cell  lung cancer (NSCLC). Lung Cancer.

2:吴一龙等，2013。中国间变性淋巴瘤激酶（ALK）阳性非小细胞肺癌诊断专家共识（2013版）。中华病理学杂志，42（6）。

3:Niu Wenquan et al. 2014.Clinicopathological and Demographical Characteristics of Non-Small Cell LungCancer Patients with ALK Rearrangements: A Systematic Review and Meta-Analysis.PLOS ONE, 9(6).

4:Ross JS et al. 2017. ALKFusions in a WideVariety of Tumor Types Respond to Anti-ALK Targeted Therapy. The Oncologist,22:1444-1450.