本文的观点取自于南京军区南京总院病理科周晓军和马恒辉老师

组织标本在离体后，要经过固定、脱水、透明、浸透和包埋等一系列的后续处理，以保证病理诊断的需要。组织处理的每一个步骤都非常重要，因为标本的取材，部位的选择等等，都或多或少地会影响到组织处理的程序、染色的效果以及最终的诊断是否合适。组织结构的保存、有效成分的保留，取决于组织处理所使用的试剂和各步骤处理的时间等因素。为病理诊断提供优质的切片需要技术人员在日常的工作中不断积累熟练的经验和技巧。

1.组织的固定

固定能有效地保存细胞核组织的成分，减少组织的损伤，是组织处理最重要的步骤之一。固定使蛋白质保持稳定，使溶酶体的活性减弱，防止细胞及其内成分自溶。在正式开始组织处理之前必须保证组织成分固定，如果组织固定不适当，不完全，可能会改变组织的染色特征。如果处理前组织固定不完全，则必须在机器处理的液槽中增加补充固定的处理。

使用特殊固定液固定的组织，在处理前需要进行相应的处理，含苦味酸固定的会形成水溶性的苦味酸盐，故处理前需要将组织放置在70%乙醇里进行处理。含乙醇的固定液，如Carnoy液体在处理前可将组织直接放进95%乙醇。

为帮助微小破碎组织，在包埋操作是易于识别操作，组织处理前可浸泡在1%伊红液中5~10mins。伊红的粉红色在组织处理时可以保留，但是在随后的切片染色中可以洗去不影响正常的染色。

2.组织的处理

组织处理步骤分为脱水、透明、浸透和包埋，目的是去除多余的水分，代之以起支撑作用的包埋剂的浸透，保证组织足够的硬度，切片时不至于使组织扭曲或损害。

2.1 组织的脱水

脱水是固定后组织处理的第一步，即从组织成分内去除游离的水分和多余的固定液。许多脱水剂是亲水的，在与组织中水分子交换时，具有强烈的极性。其他的脱水剂是通过不断地稀释组织内多余分的方式来达到脱水的目的的，脱水处理过程应缓慢进行。否则，造成细胞内外液体浓度的不平衡，当液体交换时，就会通过细胞膜发生细胞内成分扩散流动到细胞外的现象，增加细胞破坏的可能性。为此，脱水的过程常须经过一系列梯度溶液来完成。过渡脱水易导致组织变硬、变脆甚至扭曲。当然，脱水不足将阻碍透明剂渗透到组织内部，使得组织因水分过多导致标本发软，或无法透明。

脱水剂的种类有很多种，有乙醇、丙酮、甲醇、异丙基醇等。如果用乙醇进行脱水处理，其浓度最好为70%的乙醇水溶液，随后是95%乙醇和100%无水乙醇。对特别容易破碎的组织标本，推荐起始浓度为30%乙醇。变性醇使用方法同乙醇，甲醇和替代乙醇，异丙醇不易产生组织硬化和扭曲，经常用于微波处理程序。丁醇最初用于植物和动物组织学，是一种缓慢型脱水剂，极少产生组织扭曲和硬化现象。丙酮是透明无色易燃液体，易于水、乙醇和大多数有机溶液相混合。其脱水快，但渗透差，脱水时间长易引起组织扭曲和变形。丙醇用于脱水可以去除组织中的脂肪。苯酚（石炭酸）可以作为添加剂放入脱水溶液中，对筋、腱、指甲等致密组织和角化蛋白等起到软化作用。使用的方法是，将苯酚通入95%乙醇溶液，配成4%的浓度。另外，坚硬的组织也可以置入甘油乙醇混合液中浸泡。 

2.2 组织的透明

作为脱水和浸透容易之间的透明溶液，它既要能溶解于脱水液，又要能溶解于浸透液。大多数透明溶液是碳氢化合物，对组织中的蛋白具有折射能力。当脱水溶液被用于透明的溶液完全置换后，组织呈半透明状态。因此，这些溶液被称之为“透明液”。透明剂的沸点象征融化的石蜡替代透明剂的速度，低熔点的溶液一般来说较快地被置换，粘度也同样影响渗透速度。缺点是组织长时间置于透明溶液易导致组织变脆，透明时应该密切注意。在确保致密组织块能够足够透明的同时，小的易脆的组织也不至于透明过度而损坏。

二甲苯作为透明剂适用于各种大小不同的组织处理，组织处理时过度透明易造成组织变硬。甲苯与二甲苯有相同的属性，组织长时间透明也不易损伤。氯仿的透明速度比二甲苯慢，易引起组织变脆，合适的组织厚度是1mm左右。常用于神经系统的组织处理，组织块在氯仿中不会呈现“半透明”状态。甲基苯甲酸酯和甲基水杨酸酯，这两种是缓和型透明溶液，可用于双重包埋时。柠檬油试剂是从柑橘类植物如柠檬皮壳中榨取获得，无毒，易溶于水。使用后废弃时可直接经实验室处理中心处理，节能减排，符合环境保护的理念，缺点是有刺激性气味。另外，该溶液可能会使组织中铜或钙等矿物质沉淀产生溶解。

2.3 组织的浸透

石蜡是组织实验室最常用的渗透和包埋剂。它是一种从石油分解中产生的长链状碳氢化合物，具有宽泛的熔点，对各地不同的气候条件均可适应。它的物理属性根据不同的熔点而定：低熔点石蜡通常较柔软，高熔点石蜡通常比较坚硬，耐受切片。加热石蜡达到一定的温度，可以改变石蜡的熔点。石蜡熔点通常在40-70℃之间。包埋时组织经石蜡浇灌，形成模型可防止切片对组织结构的损伤。为了切片时提供优良的蜡带，应选择合适熔点的石蜡。含有增塑剂和树脂的石蜡市场有售，提供广泛的选择，方便实验室的需要。这些物质虽然能够帮助石蜡达到良好的硬度以利于包埋切片，但是，以往添加到石蜡中的物质包括：蜂蜡、橡胶、塑料聚合物等，而这些添加剂的熔点均高于石蜡，故使用时可能会使组织变脆。

2.4 组织的包埋

包埋是指将组织标本适当处理后正确排列封入支持媒介物质中，为最终的切片的提供需要。包埋的媒介物质必须充满组织标本，保持细胞的成分，提供弹性，防止切片损坏，以利于切片。许多实验室使用包埋中心，该中心由3个部分组成，自动流蜡剂器、冷台以及储备模型和组织包埋盒的热槽。石蜡经过喷嘴自动流入大小适合的包埋模。组织在包埋模型中排列方向和位置，加盖塑料包埋盒，形成一个带有组织的平行的蜡块。模型先放在一小块冷冻区域让石蜡凝埋盒，形成一个带有组织的平行的蜡块。模型先放在一小块冷冻区域让石蜡凝固，快速冷固石蜡会导致残留的水分形成“冰晶”结构，切片时产生人为的改变。

当组织包埋时，组织的方向对证明或显示组织的形态是一个重要的问题。组织的定向或定位不应该对组织切片有影响。错误的定位可能会导致所需组织成分的破坏或错误的诊断。有些辅助措施可以确保组织的正确定向：涂抹染料，使用活检组织小袋、海绵和软纸等。大部分组织是平埋的，组织周边的包埋介质将对组织起到保护作用。以下组织需要特殊定向包埋：腔性结构如动脉、静脉、脉管需横切；皮肤、肠道、胆囊、膀胱和其他上皮类活检组织，应从底下开始切片；肌肉活检；横向和长纵向切片；多块碎组织应一个接一个排列，保证组织结构在包埋时排列方向上一致。 

3.影响组织处理的因素

组织标本在包埋盒中的大小，厚薄决定了组织处理所需要的时间。通常将组织块切成（1~1.5）cm*（1~1.5）cm*0.3cm大小，厚度不能超过包埋盒的厚度，以免阻碍组织与液体的交换。如果条件允许，最好能将大小标本分开处理。当组织浸泡在液体中时，液体与组织及组织周围的相互交换就产生了。液体交换的效率取决于组织暴露并接触液体的面积。影响组织与液体交换的因素有搅拌、加湿、粘度、真空等。

搅拌有助于促进新鲜液体在周围组织的流动。自动组织处理机可以通过由垂直、旋转的振荡或施加压力的方式，定时交换液体达到机械搅拌的目的。有效的搅拌可以缩短组织标本处理时间的30%。加温可以增加液体交换与穿透的效率，但是，必须注意尽量少用，防止出现扭曲、变硬、变脆。温度最好控制不高于45℃比较有效，高温对随后的免疫组织化学有影响。

粘度是阻碍液体流量的参数。溶液里液体分子的颗粒越小，液体渗透速率就越快（低粘度）；相反，如果提分子的颗粒越大，液体交换速率就越低（高粘度）。大多数用于组织处理的溶液、脱水剂和透明剂具有相似的粘度，但松柏油除外。包埋剂具有多重粘度。石蜡溶化后呈低粘度，能增强对组织的渗透速度。利用减压能增加渗透率，缩短组织标本在每一步的处理时间。

利用真空能从组织中去除试剂，主要适用于易挥发的液体。真空能有助于去除多孔组织内的空气。致密的组织、脂肪多的组织，在处理过程中通过真空辅助，能够有效地减少液体渗透时间。真空设置用在自动组织处理机不能超过15N/Hg，以免破坏组织。