来源：摘自《临床与实验病理学杂志 2015 第 31 卷 5 月第 5 期》  作者：刘标 周晓军

非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）占所有肺癌的 80%，可以分为不同的组织学类型，主要包括腺癌（≥ 40%）和鳞癌（30%），以及较为少见的大细胞癌（large cell carcinoma，LCC）（10%）。随着肺腺癌和鳞癌个体化治疗方案的日趋不同，临床强烈要求对不同组织学类型的 NSCLC 明确诊断。

对于绝大多数手术切除病例而言，经充分取材均能够正确诊断，但病理医师在实际工作中经常面临的是小活检标本（占 70%）的诊断，此时有效的免疫标志物在辅助诊断和鉴别诊断中尤显重要。免疫标志物的重要性不仅体现在 NSCLC 不同组织学类型之间的诊断和鉴别诊断，肺原发癌与诸多类型转移癌之间的鉴别诊断，还在于明确特征性的分子学改变（如 EGFR、EML4-ALK），用于满足 NSCLC 个体化治疗和预后判断的需要。

在越来越多的免疫标志物中，如何选择简单而有效的抗体（组合）达到对 NSCLC，特别是小活检标本的病理诊断和鉴别诊断目的，本文综合国内外权威文献形成以下共识。

NSCLC 常用免疫标志物

1. 肺腺癌常用免疫标志物

（1）TTF-1

TTF-1 是肺腺癌最常用的免疫标志物之一，75%-85% 的肺腺癌表达 TTF-1，且常呈弥漫一致性的强阳性，约 20% 的肺腺癌不表达 TTF-1。TTF-1 在肺腺癌中的表达与分化程度和组织学类型有关，总体而言，肿瘤分化程度越差，TTF-1 越可能表达缺失，具有Ⅱ型肺泡上皮细胞 /Calar 细胞特征的腺癌几乎全部表达 TTF-1，泌黏液性腺癌（浸润性黏液腺癌、胶样腺癌等）呈不同程度表达（表 1）。

TTF-1 也表达于肺神经内分泌肿瘤（neuroendocrinetumors，NETs）、部分典型类癌（typical carcinoid，TC）、非典型类癌（atypical carci-noid，AC）、约 50% 的大细胞神经内分泌癌（large cell neuroendocrine carcinoma，LCNEC）及 90% 的小细胞肺癌（small cell lung carcinoma，SCLC）。通常认为肺鳞癌不表达 TTF-1。因此，TTF-1 主要用于肺腺癌和鳞癌的鉴别，不能鉴别肺腺癌和肺 NETs。

在非肺源性肿瘤中，除了甲状腺癌几乎全部表达 TTF-1 以外，少量子宫内膜、子宫颈、卵巢、乳腺和结直肠的腺癌也表达 TTF-1。与 Napsin A 不同，所有类型的肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）均不表达 TTF-1。

表 1. TTF-1 和 Napsin A 在不同组织学类型肺腺癌中的表达 

（2）Napsin A Napsin A

也是肺腺癌最常用的免疫标志物之一，70%-90% 的肺腺癌表达 Napsin A，其敏感度和特异度均优于 TTF-1，TTF-1 和 Napsin A 是目前诊断肺腺癌最优秀的抗体组合之一。与其他Ⅱ型肺泡标志物（TTF-1、细胞表面糖蛋白）相似，Napsin A 在肺腺癌中表达也与组织学类型、分化程度具有相关性（表 1）。

约 3% 的肺鳞癌表达 Napsin A，肺 NETs 不表达 Napsin A，因此可以用于肺腺癌和 NETs 的鉴别诊断。值得注意的是，正常肾组织表达 Napsin A，高达 80% 乳头状 RCC 和 34% 的透明细胞 RCC 表达 Napsin A。部分女性生殖系统来源的腺癌表达 Napsin A，见于约 7% 的卵巢腺癌和 15% 的子宫内膜腺癌，其中高达 2/3 的透明细胞腺癌表达 Napsin A。其他组织器官发生的小部分腺癌也表达 Napsin A，如甲状腺的乳头状癌和差分化（间变性）癌、胆管细胞癌等。

（3）CK7

几乎 100% 的肺腺癌均表达 CK7，极高的敏感度使 CK7 成为肺腺癌诊断和鉴别诊断最常用的抗体之一，特别是在鉴别肺原发性腺癌和转移性结直肠腺癌时，CK7 常作为首选的抗体组合成员。但 CK7 的特异性较低，30%-60% 的肺鳞癌表达 CK7。在非肺源性腺癌中，CK7 表达广泛见于乳腺、胃、卵巢、胰腺、子宫、尿路上皮等多种器官和部位发生的腺癌，

因此，在肺腺癌鉴别诊断时，需与其他特异度较高的抗体（TTF-1、Napsin A）联合应用。

（4）肺泡表面糖蛋白（SP-A、SP-B）

SP-A、SP-B 仅表达于约 50% 的肺腺癌。其表达的组织学谱系较窄，主要见于分化程度较高的具有Ⅱ型肺泡上皮细胞 /Calar 细胞分化特征的腺癌，在差分化肺腺癌常常表达缺失，对于起源于较大支气管、具有杯状细胞特征的腺癌（浸润性黏液腺癌、胶样腺癌等），肺泡表面糖蛋白几乎无诊断价值。

（5）Cam5.2

Cam5.2 是常用的低分子量角蛋白，包括 CK8 和 CK18。几乎 100% 的肺腺癌表达 Cam5.2，约 35% 的肺鳞癌和 20% 的肺 LCC 也表达 Cam5.2。此外，Cam5.2 可表达于人体几乎所有类型的腺癌，特异性较低使 Cam5.2 在肺腺癌诊断和鉴别诊断中的应用价值均非常有限。

2. 肺鳞癌常用免疫标志物

（1）p63 及ΔN p63（p40）

p63 和 p40 是肺鳞癌最常用的免疫标志物。高于 90% 的肺鳞癌 p63 呈强烈核表达，一般认为 p63 在肺腺癌中的阳性率为 10%-33%，且常常呈局灶性低水平表达。p63 诊断肺鳞癌的敏感度高达 97.4%，但特异度较低，仅有 72.8%。相当比例的肺非鳞癌表达 p63，肺 NETs 不同程度表达 p63，在 TC 和 AC 中 p63 不表达或呈较低水平（6%）表达，p63 在 13.5%-18% 的 LCNEC 以及约 22% 的 SCLC 中表达。p40 的敏感度与 p63 相似，但特异度优于 p63，高达 96.8% 的肺鳞癌均强表达 p40，仅在 3%-5% 的腺癌中表达，且常呈局灶阳性（＜5%）表达。肺 NETs 中，p40 不表达于肺类癌，仅在 3.6% 的 LCNEC 中表达。此外，2.4% 的间皮瘤表达 p40。

（2）CK5/6

CK5/6 是肺鳞癌最常用的免疫标志物之一，75%-100% 的肺鳞癌表达 CK5/6，其表达与鳞癌的分化、分级无关，但也有研究显示，20% 的低分化鳞癌不表达或仅低表达。2%-33% 的肺腺癌可表达 CK5/6，但常呈局灶性低水平表达。75%-100% 的胸膜上皮样恶性间皮瘤也表达 CK5/6，联合应用其他特异性间皮瘤标志物有助于二者的鉴别诊断。CK5/6 与 DSG3 组合可以诊断 92.6% 的鳞癌。在 p63 不表达的情况下，单一的 CK5/6 表达并不足于支持鳞癌的诊断。

（3）CK34βE12

几乎 100% 的肺鳞癌均表达 CK34βE12，但高达 89% 的肺腺癌同样表达 CK34βE12，与 p63、p40 比较，CK34βE12 特异性低且敏感性并无优势，因此不作为一线抗体使用。

DSG3 新近被广泛应用于肺腺癌和鳞癌的鉴别诊断，85%-90% 的肺鳞癌表达 DSG3，其几乎不表达于肺腺癌（﹤2%）。DSG3 和 Napsin A 鸡尾酒抗体能区别 85% 以上的肺腺癌和鳞癌。其他上皮性标志物如 MOC-31、CEA、COX-2 等在肺鳞癌和腺癌鉴别诊断中的作用价值非常有限且意义不大。

3. 肺 NETs 常用免疫标志物（本共识除外 SCLC）

肺 NETs 占所有肺恶性肿瘤的 20%-25%，包括 TC、AC、LC-NEC 和 SCLC，TC、AC 和 SCLC 的诊断主要依靠形态学特征，而 LCNEC 的诊断则常需要结合免疫标志物。CgA、Syn 和 CD56 是最常用的神经内分泌标志物组合，其中 CgA 的特异性最强。41%-75% 的 LCNEC 表达 TTF-1，约 60% 的 LC-NEC 表达 CK7。

Ki-67 增殖指数对肺 NETs 具有诊断和分级双重意义，TC 的 Ki-67 增殖指数 ≤ 5%，属于低级别 NETs，AC 为 5%-20%，属于中级别 NETs，LCNEC 通常 ≥ 60%，属于高级别 NETs。LCNEC 的诊断除依靠形态学特征，还需结合免疫组化标记或电镜检查证实神经内分泌。

免疫标志物在 NSCLC 诊断和鉴别诊断中的应用

1. 肺腺癌和鳞癌的鉴别诊断 TTF-1、Napsin A、CK5/6 和 p63（p40）是目前鉴别肺腺癌和鳞癌最常用的抗体组合之一。鉴于 p63 在 10%-33% 的肺腺癌中呈局灶性低表达，因此在判断 p63 染色结果时，仅弥漫性强表达于胞核时才能判读为阳性。同样对于 CK5/6，只有弥漫强表达时才能判断为阳性（弥漫性表达定义为﹥50% 的肿瘤细胞表达）。

通常 TTF-1/p63 组合在腺癌和鳞癌均是一个阳性而另一个阴性，如果 TTF-1/p63 均阳性，倾向于诊断腺癌，因为 p63 可以在腺癌中表达而 TTF-1 几乎不在鳞癌中弥漫表达；如果 TTF-1/p63 均阴性，则仍然怀疑腺癌，因为 TTF-1 在差分化腺癌中缺失表达的现象较常见，而 p63 在鳞癌中的表达非常稳定，一些所谓「p63 阴性的低分化鳞癌」其实可能是实体性腺癌；但 TTF-1/p63 双阴性也可见于其他类型腺癌。

所有鳞癌标志物均不能鉴别转移性鳞癌、肌上皮癌、尿路上皮癌、上皮样恶性间皮瘤，甚至包括肉瘤和大细胞淋巴瘤。p63 在部分大细胞淋巴瘤（间变性大细胞淋巴瘤、弥漫性大 B 细胞淋巴瘤等）中表达，而 p40 在上述大细胞淋巴瘤中不表达，因此选择 p40 代替 p63 能有效避免将肺或纵隔的大细胞淋巴瘤误诊为鳞癌（表 2）。

表 2. 肺腺癌和鳞癌鉴别诊断的免疫组化标志物

2. 肺腺癌与硬化性肺细胞癌（sclerosing pneumocytoma）的鉴别诊断硬化性肺细胞瘤由两型细胞组成：表面细胞和上皮圆形细胞，两型细胞均可能起源于呼吸道多潜能原始上皮细胞，具有Ⅱ型肺泡上皮的分化特征，因此表达Ⅱ型肺泡上皮细胞的免疫标志物，如 TTF-1、Napsin A 等。

但与肺腺癌弥漫一致性表达上述指标有所不同，硬化性肺细胞瘤两型细胞之间的表达模式有明显的特征。90%-100% 的硬化性肺细胞瘤两型细胞均表达 TTF-1，但与表面细胞比较，圆细胞的染色强度稍弱。表面细胞弥漫一致性表达 Napsin A、CK-pan、CK7 和肺泡表面糖蛋白，大部分表达 Cam5.2；而圆细胞不表达 CKpan 和肺泡表面糖蛋白，不表达或仅呈局灶性弱表达 Napsin A，仅 31% 的病例表达 CK7，17% 的病例表达 Cam5.2。

除此之外，圆细胞通常一致性表达 vimentin。需注意的是，上述指标的表达模式只有在手术切除标本中才能充分显现，对于小活检标本，免疫标志物对于鉴别硬化性肺细胞瘤和低级别腺癌非常困难。

3. 肺原发性癌与转移性肿瘤的鉴别诊断

（1）肺腺癌与转移性腺癌的鉴别诊断

肺是多种类型癌转移最常见的部位之一，其中腺癌可能来自胃肠道、乳腺、卵巢、子宫内膜和前列腺等器官，未知原发部位的转移性腺癌占所有肺癌的 3%-5%。鳞癌可能来自食管、头颈部、皮肤等部位，其他还包括膀胱等泌尿系统的尿路上皮癌。目前尚无有效的标志物（组合）将肺原发性鳞癌与转移性鳞癌鉴别开来。一些腺癌转移至肺脏时仍然表达「器官特异性」的标志物，借助有效的抗体组合可以进行鉴别诊断。

肺腺癌常常需要与转移性结直肠腺癌鉴别，对于大部分肺腺癌，特别是具有Ⅱ型肺泡上皮细胞 /Calar 细胞特征的腺癌，利用肺腺癌特异性的标志物如 CK7、TTF-1 和 Napsin A，以及肠癌特异性标志物如 CK20、CDX2 等易与转移性结直肠癌鉴别诊断。但部分肺腺癌可表达「肠型」标志物（CK20、CDX20），其中约 8% 的肺腺癌表达 CK20，12% 的肺腺癌表达 CDX2。

这类腺癌的主要特征是产生细胞内 / 外黏液，组织学类型包括黏液腺癌（黏液性 BAC）、胶样腺癌、肠型腺癌以及部分腺泡 / 筛状为主型腺癌，如 50%-90% 的黏液腺癌表达 CK20，且常常伴 CDX2 的表达。形态学上该类腺癌具有结直肠腺癌的特征，「肺型」标记呈不同程度的表达（表 1），使这类腺癌与肺内转移性结直肠的鉴别诊断具有挑战性。

除了常规应用免疫标志物组合以外，应综合病史、临床表现以及内镜和影像学资料进行考虑，以下表现支持泌黏液性肺腺癌的诊断：（1）临床以肺癌为首发症状，无结直肠癌病史及相关临床表现；（2）内镜和影像学检查除外结直肠肿瘤；（3）组织学除了「肠型」腺癌的特征外，还具有经典「肺型」腺癌的成分如贴壁生长、乳头或腺泡成分；（4）表达「肺型」标记如 CK7、TTF-1 或 Napsin A 等。

除了结直肠腺癌外，转移至肺的腺癌还可能来源于乳腺、肾脏、卵巢、前列腺等远位器官。乳腺癌大部分表达 ER /PR、GATA-3 囊泡病液体蛋白 -15（gross cystic disease fluid protein-15，GCDFP-15）或者乳腺球蛋白（Mammaglobin）。GATA-3 是乳腺癌的特异性标志物，在 47%-100% 的乳腺癌中表达，其中 90% 以上的腺腔型乳腺癌表达 GATA-3，但在三阴性乳腺癌中的阳性率较低（40%）。肺腺癌不表达 GATA-3，但部分东亚裔肺腺癌表达 ER，因此，鉴别诊断时需结合 TTF-1 和 Napsin A。肺腺癌不表达 Pax-8，因此 Pax-8 表达强烈支持为转移性腺癌。RCC 强烈表达 Pax-8，结合 Pax-2 及其标志物有助于诊断 RCC；Pax-8、ER 和 PR 表达则支持卵巢浆液性腺癌的诊断；Pax-8、TG 表达有助于甲状腺癌的诊断；PAS 和 PASP 表达则强烈支持前列腺癌的诊断。

（2）肺癌与胸膜上皮样恶性间皮瘤的鉴别诊断

肺腺癌和鳞癌有时需与胸膜上皮样恶性间皮瘤鉴别，特别是对于胸腔镜取样的小活检标本和胸水脱落细胞学标本。胸膜上皮样恶性间皮瘤与肺腺癌以及鳞癌鉴别诊断的常用免疫标志物详见表 3、4。

目前尚无 100% 的特异性标志物，因此应至少选择 2 个间皮和 2 个上皮标志物。根据抗体的敏感度和特异度，间皮瘤最好的标记为钙视网膜蛋白（Calretinin）、CK5 或 CK5/6、Wilms 肿瘤基因 1（Wilms tumour gene-1，WT-1）和 D2-40，肺腺癌最特异性的标志物是 TTF-1 和 Napsin A，p63/p40、DSG3 是肺鳞癌的特异性标志物，p63 和 WT-1 组合常用于上皮样间皮瘤和鳞癌的鉴别，其中 p63 在鳞癌中呈弥漫一致的强表达，而在间皮瘤中不表达；WT-1 在绝大多数上皮样间皮瘤中表达，而在鳞癌中不表达。其他肺癌标志物，如 MOC-31、Ber-EP4、CEA、BG8 也常用于鉴别胸膜上皮样间皮瘤。

Cal-retinin 在几乎所有的上皮样恶性间皮瘤中呈胞核和质弥漫一致性强表达，但其在约 40% 的肺鳞癌通常呈局灶性表达，因此对于二者的鉴别诊断作用非常有限。

表 3. 肺腺癌与胸膜上皮样恶性间皮瘤鉴别诊断的免疫组化标志物

表 4. 肺鳞癌与胸膜上皮样恶性间皮瘤鉴别诊断的免疫组化标志物

4. 肺 LCC 的诊断和鉴别诊断

按照 WHO（2004）肺癌分类，LCC 是一类未分化的 NSCLC，缺乏小细胞癌、腺癌或鳞癌分化的细胞和结构特征。根据定义，LCC 是一类排他性诊断，指的是除外小细胞癌、腺癌和鳞癌之后的排除性诊断。随着免疫标志物的广泛应用，LCC 可根据免疫表型进一步分类。

利用抗体组合包括腺癌标志物（如 TTF-1、Napsin A、CK7）、鳞癌标志物（如 p40、p63、CK5/6、DSG-3、CK34βE12）和神经内分泌标志物（如 CgA、Syn、CD56）可以将 LCC 进一步分为 4 种类型：60%-70% 为低分化腺癌，10%-20% 为低分化鳞癌，5% 为 LCNEC、其余为不表达任何标记的未分化癌（非特指类型的 LCC）。

可见大部分 LCC 实际上是低分化实体性腺癌，但由于黏液染色的敏感度太低（30%），有时该类腺癌可能不能满足 WHO（2004）分类和 2011 年肺腺癌多学科分类对于实体性腺癌的诊断标准，即 2 个高倍视野中每个视野至少有 5 个肿瘤细胞经黏液染色（AB-PAS）证实胞质内含黏液。

对于 NSCLC 免疫组化结果的解释

选择有效的抗体（组合）对 NSCLC 的诊断和鉴别诊断非常重要，但对于免疫组化结果的准确判读同样重要，病理医师在运用这些免疫标志物时，应熟悉每一种抗体的表达谱系，特异度、敏感度以及不同的亚细胞定位。除此之外，还应该牢记光镜下的组织学特征是选择有效的抗体（组合）最重要的前提基础。

通常认为，肺鳞癌不表达腺癌标志物（TTF-1、Napsin A），在肺鳞癌中，TTF-1、Napsin A 被错误判读为阳性结果可能有如下原因：将陷入癌巢内的反应性Ⅱ型肺泡上皮细胞误认为肿瘤细胞；将丧失 TTF-1 和 Napsin A 表达的差分化实体性腺癌诊断为差分化鳞癌；部分肺鳞癌可能含有少量的腺癌成分致使局灶腺癌分化的区域表达 TTF-1；肺泡内的巨噬细胞常表达 Napsin A 以及抗体的特异度和效价等。

综上所述，肺鳞癌通常不表达 TTF-1 和 Napsin A，但腺癌可不同程度的表达鳞癌标志物（CK5/6、p63），特别是部分差分化实体性腺癌，TTF-1 和 Napsin A 常不表达或呈低表达，对于这部分肿瘤在判断 CK5/6 和 p63 表达时应提高警惕，只有当肿瘤细胞呈 CK5/6 和 p63 弥漫性强烈（＞50%）表达时才能认为是阳性结果。对于 TTF-1、Napsin A、CK5/6 和 p63 均不表达的差分化 NSCLC，仍不能轻易排除肺腺癌的诊断，可以酌情考虑选择一些特异性稍差的抗体，如 CK7 呈弥漫一致性强表达，仍应谨慎考虑肺腺癌的诊断。

NSCLC 个体化治疗的免疫标志物

1. EGFR突变的免疫组化检测美国 NCCN 指南以及我国专家组共识明确指出，应用 EGFR- 酪氨酸受体阻滞剂（EGFR-TKIs）治疗进展期 NSCLC 之前应对 EGFR 突变状态进行检测，以便筛选 EGFR-TKI 治疗的最适宜对象。

EGFR 最常见（90%）的突变类型为外显子 19 的框内缺失突变（de-lE746-A750）和外显子 21 的点突变（L858R）。目前免疫组化可用于检测这两种特异性突变类型，其中检测 delE746-A750 的抗体有两种克隆号，分别为 6B6（CST 公司）和 SP111（Ventana 公司）；检测 L858R 的抗体也有两种克隆号，分别为 43B2（CST 公司）和 SP125（Ventana 公司）。

免疫组化染色评分标准通常按照细胞质和（或）细胞膜染色强度以及阳性细胞数量进行：≤ 10% 的肿瘤细胞无或仅呈微弱着色为 0 分；＞10% 的肿瘤细胞呈弱着色为 1 分；肿瘤细胞呈中度着色为 2 分；肿瘤细胞呈强着色为 3 分。结果判断标准：0 分为阴性，1-3 分为阳性。一般认为 EGFR 突变特异性抗体的特异度较高，但敏感度较差，其中检测 L858R 的敏感度明显高于 delE746-A750，这与外显子 19 和 21 存在其他少见突变类型所致的编码蛋白的构象差异有关。

6B6 和 SP111 抗体是针对 delE746-A750（15-bp）设计的，几乎不能检测外显子 19 的其他缺失类型，如 9-、12-、18- 和 24-bp 缺失；同样，43B2 和 SP125 抗体是针对 L858R 位点设计的，也不能检测 L861Q 突变。因此对于免疫组化检测阴性的病例，应警惕假阴性结果以及其他少见突变类型，需应用直接基因测序或 PCR 的方法进一步检测。免疫组化染色评分与 EGFR-TKIs 疗效：一般认为评分为 3 分的可直接使用 EGFR-TKIs 治疗，而评分为 0-2 分需进一步应用分子学方法检测 EGFR 基因突变。

2. ALK 融合蛋白的免疫组化检测 ALK 融合基因目前已被定义为 NSCLC，特别是肺腺癌的一种独特分子亚型。

NSCLC 患者使用 ALK-TKI（克唑替尼，商品名赛可瑞）治疗前应检测 ALK 融合基因或 ALK 融合蛋白。应用免疫组化检测 ALK 融合蛋白表达的抗体主要有 D5F3、5A4，其他克隆号如用于检测间变性大细胞淋巴瘤和炎性肌纤维母细胞肿瘤的 ALK1 和 SP-8 等，不适合用于检测 EML4-ALK 融合蛋白。

免疫组化染色判断为阳性细胞数﹥5% 的肿瘤细胞呈细胞质染色，根据肿瘤细胞染色强度评分：无细胞染色为 0 分；微弱胞质染色为 1 分；中度胞质染色为 2 分；强胞质颗粒状染色为 3 分。按照上述判断标准，D5F3 和 5A4 抗体的敏感性和特异性分别为 100% 和 95%-99%，其中免疫组化强阳性染色（3 分）与 FISH 检测结果具有高度一致性（达 98%）。

Ventana ALK 融合蛋白免疫组化诊断系统（罗氏公司）已经在欧洲和我国获准用于 NSCLC 的 ALK 融合突变检测。该检测系统是在全自动化仪器上操作，使检测流程和结果判读标准化。此外，该检测系统的革新之处在于使用基于非内源性半抗原、信号扩增多聚体和辣根过氧化物酶（HRP）系统的染色信号放大技术。

在不影响检测特异性的前提下，使免疫组化检测 ALK 融合蛋白的敏感性显著提高。Ventana ALK 检测系统的结果判断采用更加简便的二分类法，即仅分为阴、阳性两种，与 FISH 结果的吻合率达 98.8%，结果判读的可重复性为 99.7%。

其他少见基因突变的免疫标志物有 BRAF（V600E）突变特异性单克隆抗体（克隆号 VE1）、ROS1 融合蛋白特异性单克隆抗体（克隆号 D4D6）、RET 融合蛋白特异性单克隆抗体（克隆号 3F8）。目前，上述免疫标志物应用在 NSCLC 中的临床资料非常有限，本共识暂不推荐使用。