[导读] 选自：中华妇产科杂志2018 年12月第53 卷第12期；作者：晋薇 王利群 刘有 刘爱军
探讨子宫内膜癌组织中错配修复（MMR）基因包括MLH1、MSH2、MSH6、PMS2基因的蛋白表达及MLH1甲基化的临床意义。
收集2007—2016年10年间解放军总医院病理科确诊为子宫内膜癌的组织蜡块共420 份，采用免疫组化EnVision 二步法检测子宫内膜癌组织中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 蛋白的表达并分析其临床意义，当出现MMR 蛋白表达缺失（即MLH1、PMS2、MSH2及MSH6中的任何1个或多个蛋白表达缺失）则高度疑为Lynch综合征相关子宫内膜癌（LS-EC）；进一步采用甲基化特异性多重连接探针扩增（MS-MLPA）技术检测其中MLH1蛋白表达缺失（72份）的子宫内膜癌组织中MLH1基因的甲基化状态，当出现MLH1基因甲基化阳性时，可判定该患者为散发性子宫内膜癌，而非LS-EC。
（1）420份子宫内膜癌组织中，MMR蛋白总缺失率为34.5%（145/420），其中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白缺失率分别为17.1%（72/420）、8.1%（34/420）、7.4%（31/420）、26.2%（110/420）；MLH1和PMS2蛋白的联合缺失率为16.7%（70/420）、MSH2和MSH6蛋白的联合缺失率仅为6.2%（26/420）。
（2）病理类型为子宫内膜样癌与非子宫内膜样癌组织中MMR蛋白总缺失率（分别为32.4%、58.8%）、PMS2蛋白缺失率（分别为23.6%、55.9%）分别比较均有明显差异（P<0.01）。不同病理分化程度的子宫内膜样癌组织中MMR蛋白总缺失率及MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白缺失率分别比较均有明显差异（P<0.05）。不同手术病理分期的子宫内膜癌组织中MSH2蛋白缺失率（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分别为5.5%、10.6%、18.6%）比较有明显差异（P<0.01）。不同浸润深度的子宫内膜癌组织中MMR蛋白总缺失率（黏膜内、浅肌层、深肌层浸润分别为35.0%、30.8%、48.1%）比较有明显差异（P<0.05）。有、无淋巴结转移的子宫内膜癌组织中MMR蛋白总缺失率及MSH2、MSH6蛋白缺失率分别比较均有明显差异（P<0.05）。
（3）72份MLH1蛋白表达缺失的子宫内膜癌组织中57份DNA质量检测合格，其中MLH1基因甲基化阳性27份，甲基化阳性率为47.4%（27/57）。
子宫内膜癌组织中MMR蛋白表达缺失可能提示患者预后不良。免疫组化方法及进一步的MLH1基因甲基化检测可作为初步筛查LS-EC的方法。
Lynch综合征是由MMR基因缺陷引起的常染色体显性遗传性疾病，具有较高的恶性肿瘤发生倾向，易同时或异时发生多种肿瘤，2%～3%的子宫内膜癌及5% 的结直肠癌患者为Lynch 综合征，Lynch综合征相关肿瘤还可见于卵巢、小肠、胃、胰腺、肝胆、尿道等部位[3]。Lynch综合征在遗传学特征上最重要的表现为携带MMR基因（包括MLHI、MSH2、MSH6及PMS2基因）的胚系突变，此人群终生患结直肠癌的风险高达80%，也是子宫内膜癌、卵巢上皮性癌及胃癌等相关肿瘤的高危人群。MMR 基因发生突变时会导致微卫星不稳定性（MSI），微卫星序列为重复的DNA序列，广泛分布于基因组中，该重复特征使这些位点在复制的过程中DNA聚合时发生移位错误，从而导致基因缺失或插入及肿瘤的发生；MMR基因的功能为参与细胞增殖中的DNA修复，可准确识别及修复这些移位错误[4]。MMR蛋白为MMR基因的表达产物，在DNA 复制过程中MLH1 能与PMS2 蛋白结合参与MMR过程，MSH2与MSH6结合可形成蛋白二聚体复合物，参与识别、修复及维持稳定的过程[4]。目前，国外公认的筛查方法，即使用特异性抗体通过免疫组化的方法来检测肿瘤中MMR蛋白的表达缺失，此方法可简单地应用于子宫全切除术、内膜活检或诊刮的石蜡标本且敏感度较高，并能预测引起MMR蛋白表达缺失的基因突变（如无义突变、移码突变、大的基因组片段重排等）[5]，其表达缺失存在两种情况：（1）Lynch综合征患者出现MLH1、PMS2、MSH2 及MSH6 中的任何1 个或多个蛋白表达缺失；（2）子宫内膜癌发生甲基化表观遗传学改变，MLH1 基因启动子超甲基化导致基因沉默发生MLH1蛋白表达缺失，即为散发性子宫内膜癌[2]。本研究对420份标本进行免疫组化法检测，发现145份存在MMR蛋白缺失，即疑为LS-EC患者，占34.5%（145/420）；并发现蛋白缺失率由高到低依次为PMS2、MLH1、MSH2、MSH6（分别为26.2%、17.1%、8.1%、7.4%），即PMS2 蛋白缺失率最高，最低为MSH6蛋白。有文献报道，发生MSH6基因突变者子宫内膜癌的终生患病风险为64%～71%，而MSH2或MLH1基因突变者的终生患病风险为40%～50%[6]。本研究中，子宫内膜癌组织中MLH1蛋白缺失率较高，可能与其基因甲基化比例增高有关，MLH1基因甲基化属于散发性子宫内膜癌而不属于Lynch综合征的范畴，还需行分子检测进一步明确是否为真正的Lynch综合征。与此同时，已有学者对PMS2基因突变与Lynch综合征进行了相关性研究，认为PMS2基因突变携带者具有很弱的外显率，年龄也偏高，故未予重视，但近年的研究发现，PMS2基因突变携带者外显率较高，发病年龄也较早，应将其纳入到Lynch综合征的诊断中[7]。本研究中，PMS2蛋白缺失率最高，达26.2%，故应将其纳入Lynch综合征的诊断中并给予充分重视，以协助临床更好地提示患者的患病风险及预后。文献报道，MMR基因种系突变主要发生于MLH1-PMS2复合物，MSH2-MSH6复合物的突变起次要作用[8]。本研究中，MLH1 和PMS2 蛋白的联合缺失率达16.7%，而MSH2 和MSH6 蛋白的联合缺失率仅为6.2%，与上述文献报道的结果基本一致。而另一些国外文献报道了LS-EC 中MMR 基因的突变率，MSH2为50%～66%，MLH1为24%～40%，MSH6为10%～13%，PMS2<5%，其中PMS2基因的突变率最低这些国外的文献报道结果与本研究结果存在一定差异，可能的原因如下：（1）MMR检测依赖于免疫组化方法，会发生一定的假阴性，如MMR基因变异导致蛋白功能活性降低，但却不影响蛋白的表达及抗体的识别；同时，所用抗体批号不同以及人为主观判断的因素导致结果的差异。（2）由于人种和地域差异造成了中国妇女人群可能表现出的趋势等等，这些因素均是造成研究结果差异的原因。以上对MMR蛋白在子宫内膜癌组织中的缺失表达结果进行了分析，并基于一些国内外文献的报道，评估了各个MMR蛋白缺失的临床意义以及可能出现的假阳性或假阴性的原因，提示，哪些患者应行基因检测进一步确诊Lynch综合征，哪些患者已不属于Lynch综合征的范畴等。那么，现阶段Lynch综合征的筛查还缺乏临床大数据，尤其缺乏中国人的遗传基因变异频谱数据，故本研究收集解放军总医院近10年的临床相关数据及病例，旨在为建立1 种高效的筛查及早期诊断方法提供可靠的理论依据。
目前，针对子宫内膜癌患者的筛查年龄，有文献设定为50岁以下，有文献设定为60岁以下，也有学者认为不设定年龄限制的筛查结果更为准确[9-10]。而早期研究的结果显示，LS-EC 患者的平均年龄为47～49岁，较散发患者年龄小[11-12]。Mills等[13]对605例子宫内膜癌患者进行研究，发现25%的MMR蛋白缺失发生于<50岁的患者；另两位学者报道了年龄<50岁的患者中MMR蛋白缺失率为30%～34%[14-15]。本研究中，420例子宫内膜癌患者中，MMR蛋白在≤50岁及>50岁两个年龄段中的缺失率分别为30.0%（36/120）、36.3%（109/300），此结果与国外文献报道一致。随着年龄的增长，MMR蛋白缺失率有增长的趋势，那么是否有必要扩展筛查LS-EC的年龄范围，这个问题还需要临床大样本量研究去证实并进一步评估患者的平均发病年龄段。子宫内膜癌基于病因学及组织学等特征将其分两种类型，即Ⅰ型（子宫内膜样癌，为雌激素依赖型）和Ⅱ型（包括透明细胞癌、浆液性癌、混合型癌或癌肉瘤，为非雌激素依懒型），子宫内膜癌中大多数为Ⅰ型，具有高分化等临床特点；而Ⅱ型仅占子宫内膜癌的10%～20%，其死亡率却占到40%，具有分化低及预后差的特点[16]。本研究显示，低分化子宫内膜样癌患者的MMR蛋白总缺失率显著高于高分化患者（P<0.01）；与非子宫内膜样癌比较，MMR蛋白总缺失率及PMS2蛋白缺失率较子宫内膜样癌中高并具有显著差异（P<0.01）；MMR蛋白总缺失率在不同肿瘤浸润深度及有无淋巴结转移者中均有显著差异（P<0.05）。本研究结果提示，子宫内膜癌中MMR蛋白表达缺失可能会导致患者的不良预后，并有望成为可靠的预后预测指标。有研究指出，绝经前后且携带MMR基因突变的妇女，具有高级别肿瘤及预后较差的生物学特点[17]，与本研究结果一致。然而，对LS-EC的形态学特征还没有统一的定论，也不具有特异性，故部分学者认为应对所有子宫内膜癌患者进行筛查。
Lynch综合征患者携带胚系突变MMR基因的1个等位基因，而第2个等位基因失活导致基因组不稳定，这种基因的不稳定可由杂合性丢失、体细胞突变及启动子甲基化等原因造成[18]，1个MMR基因只有发生双等位基因改变或失活才能造成蛋白表达缺失。估计约1/3的患者临床怀疑为Lynch综合征（实际为散发性Lynch综合征而家族非遗传性患者）但并没有可识别的致病性突变，机制可能是由于MLH1或MSH2基因为表观学突变而非胚系突变，即启动子甲基化和等位基因的转录失活[19]。因此，蛋白表达缺失主要由MLH1基因启动子甲基化造成的患者，应先检测启动子甲基化，再对非启动子甲基化的患者行进一步的基因突变检测，而其他MMR蛋白表达缺失的患者可直接行分子检测。也就是说，MMR蛋白中MSH2、MSH6或PMS2之一发生缺失可高度提示有Lynch 综合征的可能，而MLH1蛋白的缺失则可能是胚母细胞突变或是由于二核苷酸胞嘧啶（CpC）岛甲基化导致的MLH1基因沉默表达的结果。脊椎动物的DNA甲基化一般发生在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）位点（即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点），经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶；DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则可诱导基因的重新活化和表达。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达下降。本研究的420份子宫内膜癌组织中，MLH1蛋白缺失率为17.1%（72/420），MLH1和PSM2的联合缺失率为16.7%（70/420），其中72份中有57份DNA 质量合格并进一步行甲基化检测，甲基化阳性率为47.4%（27/57），即认为这27例患者为散发性子宫内膜癌，而非LS-EC；余下30例可能存在MMR基因的胚系突变，即疑为LS-EC患者；而剩余15例DNA质量不合格的患者，由于蜡块放置时间较久且DNA断裂片段及杂质较多导致质量不佳，无法行甲基化检测，这也是回顾性研究及石蜡标本存在的弊端及缺陷。有研究指出，PMS2蛋白单独缺失的患者中有24% 的患者并未出现PMS2 基因的突变但存在MLH1基因突变，故PMS2蛋白若单独缺失而无相应突变时，提示需行MLH1基因的突变检测[20]。既往报道，10%～20%的子宫内膜癌组织中MLH1和PMS2蛋白联合表达缺失，但仅有小部分是因为胚系突变引起，大部分是由MLH1 基因甲基化造成[21]。现已知，结直肠癌组织中BRAF基因突变也是造成MLH1蛋白表达缺失的原因。然而，子宫内膜癌组织中BRAF基因突变非常罕见[18]。因此，在子宫内膜癌组织中见到MLH1蛋白表达缺失时并不建议检测BRAF基因突变。需要注意的是，当出现MSI分析和免疫组化检测结果不一致的时候，大部分是由于MLH1基因启动子高甲基化造成的，需要进一步判定MLH1基因启动子有无超甲基化。
Lynch 综合征具有自身独特的分子遗传学特征、临床特点及预后，而对于LS-EC的发病机制、临床病理特征以及单个MMR基因突变的研究尚处于不断发展中。MMR蛋白的检测有赖于免疫组化方法（蛋白水平的变化）及MLH1基因甲基化检测，其优点在于可结合病理的镜下形态及检测时表达下降的具体蛋白，从而提示发生变异的相应MMR基因，并通过甲基化检测排除非LS-EC患者；而缺点在于会发生假阴性、人为主观因素以及标本质量问题带来的偏差。免疫组化方法相对更为简单、便宜且能更有效地识别异常MMR 基因，其诊断Lynch综合征的敏感度和特异度分别为91%和83%[22]，故其可替代MSI检测作为首选的初步筛查方法，并有望成为诊断Lynch综合征的主要手段之一，但MMR蛋白的表达只能用来筛选Lynch综合征，而不是1项诊断性检测。目前，国内针对该病的报道仅数篇且样本量小，故对于该病的筛查及识别显得尤为重要。以上两种初筛方法对LS-EC早期筛查提供了准确的依据，对肿瘤的基因及遗传学改变的充分了解才能真正认识肿瘤的本质，更好地做出精准诊断，为精准治疗提供可靠的基础，并对患者及其家族成员的预防和治疗其他相关恶性肿瘤具有重要的临床意义。
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