作者：王维格；来源：华夏病理学网
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今年随着第二代测序技术仪器平台，分析方法的成熟和疾病诊疗迫切的需要，测序产业由于井喷似的爆发性增长。不光是国内，在全世界范围内对这一新技术带来的变革表现出无限的渴望，也同时透露出一丝丝焦躁。公立医院系统下的检验科，病理科，中心实验室摩拳擦掌，第三方服务公司也如同雨后春笋加入角逐，都不想错失这一轮的效益增长点。但是，不论是第三方服务公司还是公立医院的实验室，都需要严肃考虑的问题是：如何达到行之有效的质量控制？遇到故障是否有足够经验的人员去排除？前些天，恰逢CSCO发布了NGS质控指南，该指南以宏观的视角提供了一个框架，对于从事过NGS的医师或者研究者来说提供了一个依据和方向，但是对于对NGS不甚了解的医师来说显得比较抽象。所以下面，我用一个刚刚碰到的实例，以微观的角度诠释一下第二代测序实验室质控的重要性。
我们最近的两年内在做一个血液肿瘤经过某靶向药物治疗后，克隆演进的过程。通俗来说，克隆演进或者克隆进化就是测序比较肿瘤的各个时期（诊断时，药物治疗缓解期，药物治疗耐药/复发期，加速急变）基因的突变，染色体片段的扩增或者丢失。我们的生物信息学专家兴奋地给我们报告，我们在一个复发患者的标本中找到了一个基因的突变，而且这个基因恰恰正好是治疗靶向药物的靶点，而且突变不同于以往的点突变，而是大片段的缺失。我们得知这个消息之后，立即召开了会议，生物信息学专家仔细讲解了这个新发现的突变，我们也异常的激动，因为发现药物的靶点如此之大的结构异常，毫无悬念地可以确定其与耐药复发相关。
随着我们的探讨，我们越发的觉得不对劲原因有下：
1）我们除了做了第二代测序，还做了单核苷酸多态性（SNP）芯片，相当于给细胞做了亲子鉴定，通过这种“亲子鉴定”我们发现了突变的基因与非突变基因的SNP不一样，说明突变基因不是“亲生”的；
2）经过软件的比对，发现大片段的缺失尽然都累及该基因的内含子，而外显子则完好无损；
3）仔细查看了该基因片段的末端序列，发现有一段并不能和基因组序列吻合似乎属于外源性序列。于是我们将测序的核苷酸序列结果提交给在线数据库（BLAST）比对后发现，这段序列与一个过表达质粒高度吻合，而这个质粒正是我们的转化医学研究实验室用来做突变功能性研究的。
我们顿时恍然大悟：用来做功能性研究用的质粒中的cDNA污染了测序标本，由于cDNA只有外显子没有内含子，当然测序结果报告大片段的缺失，而缺失片段全部都是内含子。接着我们顺藤摸瓜，查看了所有仪器、试验记录，终于确定了是通过离心机而导致的核酸污染，破解了这少部分外源性核酸带来的困扰。
由于研究型实验室的设置级别要低于临床的实验室，在各种流程和操作上首先是满足研究需要便利，而临床实验室的设计首先需要满足可靠性稳定性安全性，再考虑开展项目的种类。研究样本的核酸提取都是在研究实验室完成的，所以造成了核酸污染。
经过这个故事，我们见证了一个如此栩栩如生的核酸污染的案例。不禁心有余悸，如果临床测序实验室因为质控原因造成的污染恐怕更加隐匿（都是人源性核酸），后果也更加严重（错误的指导）。除此之外，本人曾经和某些测序企业合作过，服务方往往出具一个十分冷冰冰的格式化的测序报告，服务方的数据分析人员与医生/研究人员的讨论交流十分少，而且很局限。对于数据本身，服务方又十分欠缺可视化的手段，也不会有足够的时间精力、知识背景去与医生探讨。对于试验流程，分析流程完全是在一个“黑匣子”里暗箱操作，因为这个流程（pipeline）是企业的商业机密。所以有条件的医院应当给予充分的政策资金的保障，建立良好的平台，招募合格优秀的工程师、生物信息学分析员。对于分子病理医生来说，需要对测序整个过程了解，既能根据生物信息学专家出具的遗传学报告，使用各种工具，结合临床经验，撰写诊断报告，也能敏锐的识别问题，指导生物信息学家优化、定制分析流程，监督工程师的样本制备操作。对于服务方的企业来说，也应该将目光放远，深度、内嵌式服务于客户，服务并非单向，服务的过程也是在向客户学习的过程。本质上，一个优秀的服务型产品的成功，很大方面应该归功于用户的反馈。公立医院由于制度政策的原因，未能以合适的姿态、薪资招募工程师和生物信息学专家，在这一轮浪潮中落后于企业，但是一旦解决了这个问题，掌握第一手病患/生物样本资源，有多种学科的人才智库作为保障，定能显现出相应的爆发力。
注：由于第二代测序实验较为复杂，需要很强的理化/生物学知识，如果采用机器人操作更是需要一定的理工科知识背景，所以个人认为不宜以技术员这一称呼，用工程师更加合适。
下篇预告：
分歧者：浅谈生物信息学家与医生的沟通
王维格【caiqianyilang】| 芝加哥大学病理学系
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