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改良免疫组织化学广谱细胞角蛋白联合弹力纤维染色法在肺癌胸膜侵犯诊断中的应用

中华病理学杂志 786 评论

作者:金苏 张杨鸽龄 郭芳 邓云特 王明伟(湖北省肿瘤医院病理科)

肺癌是目前死亡率最高的恶性肿瘤[1],肺癌的预后与临床分期密切相关。早期准确的病理诊断以及正确的临床分期对合理治疗和患者预后具有重要的意义。TNM分期系统是评估肺癌预后最重要的依据。国际肺癌研究协会(IASLC)肺癌第七版TNM分期标准中,脏层胸膜侵犯(visceral pleural invision)是肿瘤T分期从T1提高到T2的重要因素之一,对于最大径小于3 cm的肿瘤也不例外。相应的,脏层胸膜侵犯使肺癌TNM分期从ⅠA期提升至ⅠB期。由于辅助化疗常被用于ⅠB期非小细胞肺癌完全切除术后的患者,但无证据支持其对ⅠA期非小细胞肺癌患者有效,因此它是关键的治疗点,准确判断脏层胸膜侵犯对于患者术后治疗方案的确定至关重要。

1998年Hammer[2]首次提出用肿瘤突破脏层胸膜弹力纤维层与否作为肿瘤是否侵犯胸膜的依据,随着对脏层胸膜侵犯认识的加深,脏层胸膜弹力层的解剖意义进一步引起重视,弹力纤维染色开始被推荐用于评价脏层胸膜侵犯,并被广泛接受。Travis等[3]直接建议以新版Hammer分级作为评估脏层胸膜浸润的病理学依据,并推荐当HE染色难以判断时加做弹力纤维染色帮助判断,他建议当可以看到两层弹力纤维层时,以贴近肺实质的那层弹力纤维作为判断肿瘤是否侵犯胸膜的依据。但是由于传统弹力纤维染色中的肿瘤细胞与胸膜中增生的纤维背景较难区分,故有时对于肿瘤是否突破弹力纤维层的判断仍然存在争议。有研究摸索了用免疫组织化学细胞角蛋白(CK)染色后加染弹力纤维的方法来判断[4],但是染色对比度差,弹力纤维与背景中的胶原纤维不易区分;另外由于染色时间长达2 d,不仅导致组织脱片现象较严重,而且病理报告发出时间延长。为了在最短时间内给患者提供准确的病理报告,确保临床TNM分期的准确性,我们对染色方法进行改良,探讨出了一种快速、高质的免疫组织化学广谱CK(CKpan)+弹力纤维联合染色法。

一、资料与方法

1.组织标本:

湖北省肿瘤医院2016年3—7月的非小细胞肺癌难以判断胸膜侵犯与否的手术标本18例,组织为经3.7%中性缓冲甲醛液固定的石蜡包埋组织,切片3 μm。

2.试剂:

(1)免疫组织化学试剂:一抗CKpan、二抗和二氨基联苯胺(DAB)试剂盒均购自Dako公司;(2)弹力纤维试染色剂盒购自珠海Baso公司(货号BA-4083A),包括高锰酸钾、草酸、Elastin染液(主要成分为碱性品红)和Van Gieson染色液(主要成分为酸性品红);(3)Rubber Cement橡胶胶水,购自北京中杉金桥生物技术有限公司(货号ZLI-9730)。

3.免疫组织化学CKpan+弹力纤维联合染色法:

免疫组织化学染色为二步法,弹力纤维采用EVG染色法,加热代替高锰酸钾氧化暴露弹力纤维,使Elastin染液易于与弹力纤维结合,Van Gieson衬染胶原纤维和肌细胞。具体流程如下:切片脱蜡至水,pH9.0高压修复1 min 30 s,一抗37 ℃ 1 h,二抗37 ℃30 min,DAB显色10 min,流水冲洗;经95%乙醇清洗后,迅速用Rubber Cement橡胶胶水在玻片上均匀划线,将组织圈起来,滴加Elastin染液于圈线区内,盖玻片盖上形成封闭染色区,防止染料挥发,影响组织染色。将玻片置于加水的避光湿盒中,37 ℃4 h,95%乙醇分化5 s,洗去残留的维多利亚蓝染液;流水冲洗后,Van Gieson染液对比染色1 min,迅速经95%乙醇清洗,无水乙醇脱水,中性树胶封片。

二、结果

经改良后,染色质量明显提高,且染色时间大大缩短。孔洁等[4]的染色法中,弹力纤维为蓝绿色,苏木精对比染色后细胞核呈蓝色,弹力纤维与背景中的组织结构对比度不高,弹力纤维较难辨认,不易观察胸膜侵犯情况;且免疫组织化学一抗孵育过夜,维多利亚蓝染色过夜,染色时间长达2 d。改良的方法不仅提高了各组织结构染色的对比度,而且分别针对免疫组织化学染色和弹力纤维染色的流程进行改进,大大缩短了染色时间,确保在最短时间内为临床医师和患者提供准确的病理报告(表1)。经改良的联合染色法染出的切片,弹力纤维为蓝黑色,与红色胶原纤维、黄色的肌纤维和红细胞对比鲜明,结构层次分明,易于观察弹力纤维的完整情况;肿瘤细胞经免疫组织化学CKpan染色,能清晰显示与贴近肺实质的弹力纤维的关系,反映出胸膜侵犯与否(图1,图2,图3,图4)。将此联合染色法应用于肺癌胸膜侵犯诊断中,能够快速、准确地判断胸膜侵犯与否,同时优化的染色方法将染色时间由2 d缩短至7 h,报告发出时间提前了1~2 d,满足了临床医师和患者的需求,也缩短了病理报告发出时间。

改良免疫组织化学广谱细胞角蛋白联合弹力纤维染色法在肺癌胸膜侵犯诊断中的应用

改良免疫组织化学广谱细胞角蛋白联合弹力纤维染色法在肺癌胸膜侵犯诊断中的应用

表1 改良前后方法对比

改良免疫组织化学广谱细胞角蛋白联合弹力纤维染色法在肺癌胸膜侵犯诊断中的应用

图1~4不同染色方法显示脏层胸膜弹力纤维层与肿瘤是否侵犯胸膜的关系中倍放大;图1 为 HE 染色,弹力纤维不易区分;图2 为免疫组织化学广谱细胞角蛋白(CKpan)染色,阳性定位仅能显示肿瘤细胞,无法同时反映肿瘤细胞与弹力纤维的关系;图3  为EVG弹力纤维染色,可清晰看到弹力纤维结构,但肿瘤细胞不易观察;图4  为免疫组织化学CKpan联合弹力纤维染色,弹力纤维结构清晰,与周围胶原纤维对比明显,肿瘤细胞定位准确,绿色箭头所示为侵犯胸膜的CKpan阳性肿瘤细胞,红色箭头所示走向为脏层胸膜的弹力纤维。

三、讨论

许多特殊染色的切片在染色前都需要氧化,用以打开特定的化学基团,便于染料更好的附着上色。免疫组织化学与特殊染色联合染色法中,免疫组织化学染色与特殊染色的先后顺序经过验证,只能是先进行免疫组织化学染色。我们曾尝试各种修复方法,将弹力纤维染色的切片进行免疫组织化学染色,包括高压修复、微波修复等,由于特殊染色的机制尚不明确,在修复中弹力纤维的颜色均会褪去。所以我们确定了经免疫组织化学染色后再行弹力纤维染色的方法。

目前免疫组织化学技术非常成熟,我们推荐一抗采用37 ℃孵育1 h,避免背景着色。而弹力纤维染色需用高锰酸钾氧化、草酸漂白。但是免疫组织化学染色的棕褐色会被漂去褪色,镜下阳性定位染色不够清晰。为了达到最好的效果,我们进行改良,采用加温代替氧化。弹力纤维中含有丰富的二硫键(R-S-S-R)糖蛋白,其酸性易与染液中的碱基结合,经染色而被辨认。通过加热,弹力纤维的二硫键能与Elastin染液中间苯二酚的酚基更易形成氢键而使弹力纤维被染成蓝黑色。但加温会导致Elastin染液易挥发,影响染色效果;而浸染法需要的染液量大,且Elastin染液具挥发性,加温后不宜再重复使用,试剂用量大。Baso公司试剂盒操作说明中给出的方法为浸染法,Elastin染液染色24 h。我们进行了摸索与改良,采用Rubber Cement橡胶胶水在组织周围均匀划线,厚底约2 mm。滴加Elastin染液后,加盖玻片,形成封闭的染色空间,既可以防止试剂挥发组织干片,又节省试剂。经反复试验,我们确定37 ℃ Elastin染液染色4 h的方法效果佳。因此,我们将原染色时间2 d缩短至7 h。

改良的免疫组织化学CKpan+弹力纤维联合染色法染液采用EVG法,弹力纤维呈蓝黑色,经Van Gieson复染后的胶原纤维呈红色,肌纤维和红细胞呈黄色,CKpan所示的瘤细胞胞质深棕黄色,一方面使弹力纤维的着色更加清晰,与其他组织结构对比清晰,另一方面通过CKpan的定位表达,使肿瘤细胞与胸膜的关系更易判断。此改良的联合染色法不仅可以用于常规评估脏层胸膜侵犯,还对脏层和壁层胸膜间有致密纤维粘连导致胸膜融合闭塞的病例中胸膜侵犯的诊断有较大的帮助。

改良的免疫组织化学CKpan+弹力纤维联合染色法操作简便,结果准确,不仅提高了胸膜侵犯的诊断准确性,也缩短了报告时间,能更大程度的造福病患,值得广泛开展。


参考文献

[1]陈万青,郑荣寿,张思维,等。 2012年中国恶性肿瘤发病和死亡分析[J]. 中国肿瘤,2016, 25(1):1-8.DOI:10.11735/j.issn.1004-0242.2016.01.A001.

[2]HammerSP. Common tumors [M]//DailDH, HammerSP. Pulmonary pathology. 2nd ed. New York: Springer Verlag,1994:1138.

[3]TravisWD, BrambillaE, Rami-PortaR,et al. Visceral pleural invasion: pathologic criteria and use of elastic stains: proposal for the 7th edition of the TNM classification for lung cancer[J]. J Thorac Oncol, 2008, 3(12):1384-1390. DOI: 10.1097/JTO.0b013e31818e0d9f.

[4]孔洁,张伟,季琳,等。免疫组织化学细胞角蛋白与弹力纤维双重染色在评估肺癌侵犯胸膜中的应用[J]. 中华病理学杂志,2015,44(9):659-660.DOI: 10.3760/cma.j.issn.0529-5807.2015.09.012.

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